[發明專利]一種用于三維生物打印的人脂肪間充質干細胞共混物和三維生物打印人體骨組織的方法

在審

• 申請號: 201710168445.4
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN107029294A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 曾明哲;高守泉
• 申請（專利權）人: 湖南未名三胞轉化醫學科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/20;A61L27/22;A61L27/56;A61L27/50;B33Y70/00
• 代理公司: 廣東廣和律師事務所44298
• 代理人: 陳巍巍

1.一種用于三維生物打印的人脂肪間充質干細胞共混物，其特征在于，其包含人脂肪間充質干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物。

2.根據權利要求1所述的人脂肪間充質干細胞共混物，其特征在于，所述混合物中，海藻酸鈉的濃度為15-25g/L，明膠的濃度為75-85g/L, 人脂肪間充質干細胞密度為0.5×10⁶-2×10⁶個/mL。

3.根據權利要求1或2所述的人脂肪間充質干細胞共混物，其特征在于，所述混合物中海藻酸鈉的濃度為20g/L，明膠的濃度為80g/L, 人脂肪間充質干細胞密度為1×10⁶個/mL。

4.根據權利要求1或2所述的人脂肪間充質干細胞共混物，其特征在于，所述人脂肪間充質干細胞是將購買的人脂肪間充質干細胞中加入增值培養基進行傳代培養后收集的第四代種子細胞。

5.根據權利要求4所述的人脂肪間充質干細胞共混物，其特征在于，所述增殖培養基為DMEM+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素。

6.一種利用權利要求1所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法，其特征在于，該方法包括：

傳代培養：將人脂肪間充質干細胞置于增值培養基中進行傳代培養；

制備人脂肪間充質干細胞共混物：將海藻酸鈉與明膠干粉分別用生理鹽水溶解，混合后制成混合溶膠，上述傳代培養后的第四代人脂肪間充質干細胞加入到混合溶膠中，攪拌均勻后得到人脂肪間充質干細胞共混物；

設計打印物形狀：參照傳統組織工程學支架結構將打印體設計為多孔網絡結構；

三維打印成型：將上述人脂肪間充質干細胞共混物置于三維生物打印機的料盒中，打印成預先設計好的結構，得到打印成型的組織結構；

交聯處理：將上述打印成型的組織結構用CaCl₂和KCl₂的混合溶液對其進行交聯，得到打印人體骨組織。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，該方法還包括對傳代培養后的第四代人脂肪間充質干細胞成骨分化能力的鑒定：待第四代人脂肪間充質干細胞生長至70%-80%匯合后接種至六孔板，加入成骨培養基，成骨誘導7天后，進行堿性磷酸酶染色，以細胞胞質呈現藍紫色判斷為陽性；成骨誘導14天后，進行茜素紅礦化結節染色，PBS沖洗細胞三次，體積分數為95%冰乙醇固定30分鐘；蒸餾水沖洗3次，每孔加1ml茜素紅染液，常溫放置，染色20-30分鐘；染色結束后洗去染液，蒸餾水沖洗，以細胞間質出現紅染結節判斷為陽性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述成骨培養基為DMEM+10%胎牛血清+1青、鏈霉素+10mmol/Lβ-磷酸甘油+200mmol/L抗壞血酸+100nmol地塞米松。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，制備人脂肪間充質干細胞共混物具體步驟為：將購買的人脂肪間充質干細胞加入增值培養基中，置于體積分數5%的CO₂、37℃細胞培養箱培養至6-8天，細胞生長至70%-80%匯合狀態后，進行細胞傳代，每個培養皿中的細胞依次經過胰酶消化、中和、離心和重懸后，接種至3個培養皿中，6-7天匯合度達到80%-90%后，再次進行傳代；傳代兩次后的標記為P4，作為種子細胞待用。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，三維打印成型過程中，具體參數如下：打印溫度15℃，打印噴頭直徑250μm，打印微絲直徑200μm，微絲中心間距400μm；打印時打印噴頭運動，將噴出的共混合物拉成絲狀，沉積到載有無菌細胞培養皿的平臺上，逐層完成打印。