[發(fā)明專利]一種青枯雷爾氏菌菌株

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710167621.2
• 申請(qǐng)日: 2017-03-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106939291A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉波;陳德局;朱育菁;鄭雪芳;車建美;陳倩倩;王階平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務(wù)所(普通合伙)35212
• 代理人: 宋連梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種青枯雷爾氏菌菌株。

背景技術(shù)

青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)是一種具有破壞性的土傳性植物病原菌，地理分布廣泛，寄主范圍廣，從單子葉植物到雙子葉植物，從喬木到灌木，可侵染50多個(gè)科的200多種植物，包括重要的經(jīng)濟(jì)作物如番茄，馬鈴薯等。該病原菌從寄主植物的根部，入侵木質(zhì)部導(dǎo)管，通過(guò)維管束系統(tǒng)迅速擴(kuò)張到植物的地上部分，大量定殖引起導(dǎo)管功能喪失，引發(fā)植物萎蔫，導(dǎo)致植物死亡。青枯雷爾氏菌是造成農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失第二嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，常用的防治方法為農(nóng)用鏈霉素，效果不好并給環(huán)境造成污染，病菌易產(chǎn)生耐藥性而不能最終控制青枯病的發(fā)生，因此生防技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)成為目前防治青枯病的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

青枯雷爾氏菌的致病性機(jī)制較復(fù)雜，在寄主植物細(xì)胞存在的情況下，青枯雷爾氏菌激活細(xì)胞壁降解酶、過(guò)敏反應(yīng)以及由Ⅲ型分泌系統(tǒng)組分編碼的致病基因，其一旦進(jìn)入植物組織中，高密度青枯雷爾氏菌大量表達(dá)毒力因子、胞外蛋白以及主要致病決定因子。為了避免經(jīng)濟(jì)作物因遭受青枯雷爾氏菌侵染而導(dǎo)致萎蔫或枯死的現(xiàn)象，從業(yè)人員一直在致力于對(duì)青枯雷爾氏菌的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種青枯雷爾氏菌菌株。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種青枯雷爾氏菌菌株，所述菌株為青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)，于2016年01月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.11995。

進(jìn)一步地，所述青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)的phcA基因含有一個(gè)插入序列，所述插入序列如SEQ ID NO：5所示。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供了一種無(wú)致病力的青枯雷爾氏菌菌株，為防治因青枯雷爾氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的生物防治提供可能植物疫苗。

具體實(shí)施方式

一種無(wú)致病力的青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199是從福建省南平市建甌市番茄病株植株莖部分離并篩選得到的菌株。

1、菌株FJAT-15199的分離：

(1)稱取發(fā)病初期番茄的莖部5g并用清水沖洗干凈，且將沖洗后的莖部剪成小塊組織；接著在無(wú)菌操作條件下，將小塊組織依次采用70％酒精處理30s，10％次氯酸鈉消毒10min，無(wú)菌水漂洗3遍；之后采用榨汁機(jī)將小塊組織打碎以獲得組織液，然后吸取1mL組織液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7；

(2)取上述各稀釋液100μL涂布于TTC培養(yǎng)基平板上，然后將TTC培養(yǎng)基平板置于28℃下培養(yǎng)3d；

(3)將步驟(2)培養(yǎng)獲得的菌株重新劃線接種于TTC培養(yǎng)基上，并將TTC培養(yǎng)基置于28℃條件下培養(yǎng)72h，獲得青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199。

2.青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199的鑒定：

初步鑒定：

將上述所獲得的菌株的菌落置于Leica M165FC高級(jí)電動(dòng)熒光體視顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察，觀察結(jié)果顯示，菌落形態(tài)為表面較干燥，無(wú)流動(dòng)性，中間為暗紅色，且白邊較窄的菌株，因此，可初步認(rèn)定為青枯雷爾氏菌。

進(jìn)一步鑒定：

(1)菌株活化：用接種環(huán)將所獲得青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199劃線于TTC培養(yǎng)基上，并將TTC培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，培養(yǎng)溫度為30℃；

(2)制備種子液：將步驟(1)所獲得的單菌落接種于20mL的種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24h，恒溫振蕩搖床的溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為170rpm/min；

(3)基因組DNA的提?。喝〔襟E(2)所獲得的種子液1mL于已滅菌的1.5mL離心管中，并按照Promega試劑盒說(shuō)明書操作以提取青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199的基因組DNA；

(4)青枯雷爾氏菌菌株FJAT-15199的16s鑒定：用原核生物通用引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG(如SEQ ID NO：1所示)和1492R：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T(如SEQ ID NO：2所示)擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，通過(guò)Blast分析，確認(rèn)菌株FJAT-15199為青枯雷爾氏菌。