[發明專利]一種基因載體介導的基于CRISPR/Cas9基因編輯系統的sgRNA及其用途

有效

• 申請號: 201710167563.3
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN107475255B
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 段偉松;吳小兵;李春巖
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學第二醫院;北京五加和分子醫學研究所有限公司;北京瑞希罕見病基因治療技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66;A61K48/00;A61K31/7105;A61P25/02;A61P21/00
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本發明提供一種用基因載體（包括但不限于9型腺相關病毒）介導的，基于CRISPR/Cas9基因編輯系統直接編輯超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1，簡稱SOD1）突變基因，在體外及轉基因小鼠中治療肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，簡稱ALS）的基因治療方法。本發明提供的重組病毒是有生物學活性的，有希望成為ALS基因治療的候選病毒。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種AAV9病毒載體介導的基于CRISPR/Cas9基因編輯系統的sgRNA及其用途，包含與該sgRNA的組合物、重組表達載體和基因治療方式。

背景技術

肌萎縮側索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一種致死性的神經退行性疾病，作為運動神經元病的一個類型(ALS/MND)，是最常見的成年發病的運動神經元疾病。ALS與阿爾茨海默病、帕金森病同為神經系統常見變性疾病，但發展速度和性質較其他兩種變性疾病更加嚴重。患者以脊髓、腦干、大腦皮層的運動神經元發生退行性改變為特征，表現為進行性肌肉無力，多死于呼吸衰竭；成年發病，中位生存期僅為3-5年[1]。其患病率4-6/10萬，發病率1-3/10萬。至今尚無有效的治療方法[2]。現臨床上用于治療ALS的藥物“力如太”僅能延緩病程數月。神經科專家多稱ALS為“不是癌癥的癌癥”。由于本病好發于中年人群，即社會及家庭的主要支撐人群，因此給家庭帶來了沉重的負擔，對國家和社會造成了嚴重的危害。通過建立有效的治療措施，不僅能減輕患者的痛苦，而且會給家庭、國家及社會減輕負擔。

ALS以散發病人多見，約占總病人的90％，家族性約占10％。基因突變是ALS鑒定明確的病因。超過50％的家族性肌萎縮側索硬化(FALS)病人的相關致病基因已經發現，其中包括：C9orf72(24％)，SOD1(20％)，TDP-43(5％)，FUS(5％)等。散發性肌萎縮側索硬化(SALS)病人中包括：C9orf72(4％)，SOD1(2％)，TDP-43(1％)，FUS(1％)等[3]。對突變基因進行基因編輯，修復突變基因有可能從根本上阻止運動神經元變性。

成簇的規律間隔的短回文重復序列-CRISPR相關蛋白9(CRISPR-Cas9)系統是最近建立的能夠在真核細胞中應用的，由RNA調控對DNA修飾的基因編輯系統。與其他編輯系統相比，如鋅指核酸酶(ZFNs)和類轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)，CRISPR-Cas9系統編輯效率和靶向性更高，打靶容易，具有多位點修飾等特點[4,5]。Cas9核酸酶在sgRNA的引導下介導目的基因的原間區毗鄰序列(PAM序列，NGG)上游3個堿基的雙鏈斷裂，Cas9上的HNH結構域切割與sgRNA形成互補的單鏈DNA，Ruv C結構域切割非互補的單鏈，通過內源性DNA修復，進行非同源末端連接(nonhomologous end joining,NHEJ)，形成插入或缺失突變(indel mutation)，完成基因敲除；在模板鏈存在的條件下，完成同源重組修復(Homology-Directed Repair,HDR)[6-8]。

腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體作為一類新型的安全載體，其重要性正被研究者逐漸認識到。它是細小病毒家族成員，為無包膜的線性單鏈DNA病毒，具有廣泛的宿主范圍，既能感染分裂細胞又能感染非分裂細胞，并能介導外源基因的長期表達。作為病毒載體的重要一員，AAV不具有明顯的細胞毒性效應，并且不會像其他病毒載體那樣引起細胞強烈的免疫反應；同時在構建重組AAV病毒時，可使其編碼序列完全缺失而僅保留其145bp的末端重復序列，從而有效降低其重組和表達自身蛋白的可能性，使安全性得到進一步提高。因此，AAV作為一種理想的基因治療載體，正在越來越多地引起人們興趣和關注[9,10]。