[發明專利]一種基于循環酶修復介導的雙信號放大策略檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法

有效

• 申請號: 201710166336.9
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN106995840B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 張春陽;王黎娟;王子月
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/34
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明公開了一種用于檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，通過由胸腺嘧啶DNA糖基化酶引發、酶修復輔助的循環滾環指數擴增和核酸內切酶Ⅳ催化介導的循環切割實現實時檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的熒光方法；由于尿嘧啶切除輔助的循環滾環擴增和基于核酸內切酶Ⅳ的循環切割效率都很高，且尿嘧啶介導的指數擴增能極大地抑制非特異性擴增，因此該方法的檢測靈敏度很高，經檢測，所述方法對胸腺嘧啶DNA糖基化酶的檢測下限可達5.6×10^?7U/μL；同時，本發明利用胸腺嘧啶DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的自身修復特性，使整個修復反應嚴格按照自然修復機制進行，因此本方案的特異性很高。

技術領域

本發明屬于生物分析技術領域，具體涉及一種基于循環酶修復介導的雙信號放大策略檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法。

背景技術

胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)是體內堿基切除修復(BER)路徑中非常重要的起始酶。在受損的基因組DNA中，其能特異性識別鳥嘌呤/胸腺嘧啶(G/T)和鳥嘌呤/尿嘧啶(G/U)的錯配堿基對，并切除錯配堿基胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。在DNA脫甲基化反應過程中，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)同樣扮演著重要的角色。通過脫氨基-堿基切除修復反應，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)能高效地切除由十-十一轉位(ten–eleven translocation，TETs)酶氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)所產生的5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。另外，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)還可以以配體依賴性方式與核受體(視黃酸受體(RAR)和類視黃醇x受體(RXR))相互作用，調節基因的表達。根據現有文獻報道，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的異常表達會直接擾亂基因組DNA的修復、穩定的表觀遺傳以及正常的轉錄調節，從而引發包括癌癥在內的多種疾病。因此，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的超靈敏檢測不僅對基礎生物化學的深入研究有很大幫助，而且對發展人類疾病新的治療策略有重大意義。

迄今為止，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的檢測方法仍然很少，其中凝膠電泳法是最普遍的方法，但是該方法存在檢測靈敏度低、放射性污染、耗時較長等缺點。近年來，發展出了一些新的檢測方法如熒光分析法和電化學分析法。通常在熒光分析法中，設計一對相距很近的熒光和淬滅分子，當胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在時，淬滅分子被釋放，導致熒光分子發出熒光，最終通過檢測熒光信號對酶活性進行定量分析；在電化學分析法中，有報道指出由DNA-量子點(QDs)聚合物超晶格結構的協助可以實現對目標檢測物的三步信號放大，然而上述方法均存在靈敏度提高有限的問題。因此，發展一種新的方法用于快速、靈敏、特異性檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性是目前亟待解決的問題。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明提出一種檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的方法，該方法采用循環酶修復介導的雙信號放大策略，具有靈敏度高、特異性好等優點。

具體的，本發明涉及以下技術方案：

首先，本發明提供一種基于循環酶修復介導的雙信號放大策略檢測胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)待測胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)誘導的胸腺嘧啶切除修復：雙鏈DNA底物中加入待測胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸內切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸、脫氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述雙鏈DNA其中一條為環形模板DNA，另一條為線性探針，所述環形模板DNA與線性探針的部分序列雜交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的雙鏈DNA底物；雜交區域內線性探針上設計有且僅有一個錯配的胸腺嘧啶；通過胸腺嘧啶DNA糖基化酶特異性地切割脫氧核糖和胸腺嘧啶之間的N-糖苷鍵，從而剪切掉線性DNA探針上錯配的胸腺嘧啶，產生一個脫堿基(AP)位點；然后核酸內切酶Ⅳ(Endo IV)將對脫堿基(AP)位點進行剪切，從而導致線性探針3’端部分序列的斷裂；