[發明專利]基于體外定點突變獲得的油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因及應用

在審

• 申請號: 201710166233.2
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN107058350A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 陳松;浦惠明;彭琦;張潔夫;胡茂龍;付三雄;陳鋒;周曉嬰;龍衛華;高建芹;張維;王曉東
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 張素卿

1.一種基于體外定點突變獲得的油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因，其特征在于，該基因mALS₃是利用體外定點突變技術獲得的，是在授權專利ZL201310111739.5公開的抗除草劑油菜M342的ALS₃基因序列中引入一個新的突變位點，該位點位于ALS₃基因的第560位，原來是C堿基，編碼187位的丙氨酸，經突變成T堿基后則在187位變成了纈氨酸，該基因mALS₃序列為：SEQ ID NO.1。

2.權利要求1所述一種基于體外定點突變獲得油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因mALS₃的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，是指所述油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因mALS3在植物抗ALS抑制劑類除草劑方面的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，所述ALS抑制劑類除草劑是指咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑嘧啶磺酰胺類或嘧啶水揚酸類除草劑。

5.根據權利要求4所述的應用，所述ALS抑制劑類除草劑是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、雙氟磺酰胺或雙草醚除草劑。

6.根據權利要求3所述的應用，是指所述油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因mALS3在擬南芥抗ALS抑制劑類除草劑方面的應用，具體為：

1)引物設計：

2)抗除草劑油菜ALS₃基因克隆：以抗除草劑油菜M342基因組DNA為模板，用引物對ALSF/ALSR及高保真DNA聚合酶擴增油菜的ALS₃基因：

擴增體系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因組DNA1μl，10μM 35-S-ALSF1μl，10μM ALSR 1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，補足ddH₂O到50μl；

溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個循環后，72℃，5min,瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，膠回收純化2Kb的PCR產物并克隆到peasy-T1載體上經測序確定，獲得克隆有抗除草劑油菜M342ALS₃基因的peasy-T1質粒；

3)利用重疊PCR引入堿基突變

以克隆有抗除草劑油菜M342的ALS₃基因的peasy-T1質粒為模板，分別用引物對ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR擴增出上游片段572bp和下游片段1412bp；

擴增體系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因組DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，補足ddH₂O到50μl；

溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35個循環后，72℃，5min；

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約572bp和1412bp的上、下游PCR產物后,以上、下游產物的混合物為模板，用引物對ALSF/ALSR擴增出全長的ALS₃基因序列；

擴增體系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因組DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，補足ddH₂O到50μl；

溫度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個循環，72℃，5min；

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約2000bp的片段，然后克隆到peasy-T1上，并測序分析，該產物序列除了在560處引入了點突變C/T外，其余堿基序列與M342的ALS₃基因序列完全一致，定名為mALS₃；

4)植物表達載體構建：以載體pCAMBIA2300質粒DNA為模板，分別用引物對p0390-35SF/35SR和ALS-nosF/nosp0390R擴增35S啟動子序列450bp和nos終止子序列250bp，膠回收相應大小的PCR產物；

以克隆有mALS₃基因的peasy-T1質粒為模板，用引物對35S-ALSF/ALSR擴增mALS₃基因，膠回收大小約2000bp的PCR產物，通過重組反應克隆到smalI酶切線性化的pCAMBIA0390載體上:

反應體系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS₃PCR產物2μl，35S PCR產物2μl，nos PCR產物2μl，Exnase^TM 2μl，線性化載體4μl,ddH₂O 2μl，于37℃下反應30min，后取5-10μl反應液轉化大腸桿菌DH5α，挑克隆PCR鑒定，抽提質粒酶切鑒定，最終經測序確定后，由此獲得的質粒定名為p0390-mALS₃；

5)擬南芥轉化:用上述獲得的植物表達載體質粒p0390-mALS₃轉化農桿菌GV3101，采用農桿菌液浸花的方法轉化擬南芥；

6)抗除草劑擬南芥植株的篩選：播種經含質粒p0390-mALS₃農桿菌GV3101轉化處理的擬南芥T₀代種子，在苗期進行ALS抑制劑類除草劑的抗性鑒定，經過除草劑篩選，獲得抗除草劑植株。