[發明專利]一種帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710164840.5
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN106834348B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 王承寶
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N7/01;C12Q1/70;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 苗燕

本發明提供了一種帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發明提供的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構建方法帶有熒光標記基因的熒光標記表達盒連接至感染性克隆質粒上的連接位點，連接位點位于N蛋白基因序列的下游和3’端非編碼序列的上游之間，得到可視化的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該構建方法操作難度小、可操作性強，能夠獲得穩定的表達熒光蛋白的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其為進一步開展新型病毒疫苗研制及豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關基礎研究提供了有力工具。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體而言，涉及一種帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構建方法和應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)屬于套氏病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為15.4kb，基因組3’末端有Poly(A)尾序列，5’末端有帽狀引導序列。其基因組含有9個相互重疊的開放讀碼框(openreading frame,ORF)。在PRRSV的結構蛋白中，GP5、M、N蛋白是主要結構蛋白，而GP2a、2b、GP3、GP4是次要結構蛋白。

反向遺傳學(Reverse genetics)技術相對于經典遺傳學方法具有方法簡便、定點可控等優點，在研究病毒的分子生物學以及病毒的致病機理中發揮著重要的作用。RNA聚合酶II(RNA polymerase II)拯救系統直接利用真核生物RNA聚合酶II啟動子驅動病毒轉錄，一般選用CMV啟動子、SV40啟動子、肌動蛋白基因啟動子等。RNA聚合酶II拯救系統有很突出的優點：避免了體外長時操作RNA的步驟；RNA polymerase II有校正功能，錯配率相對較低，可保證病毒基因組的準確性；所有的真核細胞內都有RNA聚合酶II，所以該系統有廣泛的細胞適應性；步驟簡便，既不需要轉染RNA，又不需要額外提供T7RNA聚合酶，經濟實用。轉染72小時后收獲培養上清，過濾后繼續敏感細胞傳代救獲病毒。對基因組cDNA進行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統可獲得相應的突變或重組的負鏈RNA病毒。

自2006年以來出現的由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起的HP-PRRS，以發病率和死亡率高、傳播迅速為特征，給我國養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前在中國流行的PRRSV毒株與之前的流行株相比，在遺傳變異、毒力和致病性等方面發生了很大改變，使我國PRRS的防治面臨更嚴峻的挑戰。但是到目前為止PRRSV毒力增強的機制還不清楚，因此，非常有必要建立高效經濟的HP-PRRSV的反向遺傳學技術操作平臺，PRRSV作為病毒疫苗載體應用的經濟意義十分巨大。但是，現有的用于研究的PRRSV基礎材料其在應用過程中不便于觀察，其傳代能力較差，給對PRRSV的深入研究帶來了不便。

發明內容

本發明的目的在于提供一種帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構建方法，該方法可以構建出可視化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒深入研究提供便捷。

本發明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該病毒具有可視化的特點，在其應用過程中，能夠被方便地觀察，且其傳代能力好。

本發明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒篩選抗病毒藥物中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備抗病毒藥物中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗中的應用。

本發明是這樣實現的：