[發明專利]焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變引物及其應用

在審

• 申請號: 201710163647.X
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN106987622A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 任緒義;張鋒;虞閏六
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 丁靜靜,肖明芳

1.一種焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變引物，其特征在于，包括SEQ ID NO：1～2所示的擴增引物對、SEQ ID NO：3所示測序引物以及擴增阻滯引物，所述的擴增阻滯引物的5’末端最后兩個堿基與擴增引物的上游引物3’端前兩個堿基序列相同；

其中，SEQ ID NO：2其5’端標記生物素；

以上核酸序列在一次檢測中共同使用。

2.根據權利要求1所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變引物，其特征在于，所述的擴增阻滯引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：4的3’端磷酸化處理。

3.一種焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變試劑盒，其特征在于，它包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑；

(2)PCR反應試劑：PCR緩沖液，引物SEQ ID NO：1～4 10μM，MgCl₂ 2mM，KCl 50mM，dNTPs 0.2mM，Taq DNA聚合酶2U/μL；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽溶液，結合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

4.根據權利要求3所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變試劑盒，其特征在于，所述的PCR緩沖液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明膠，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)吐溫-20，0.06M pH8.9N-三(羥甲基)甲基甘氨酸。

5.根據權利要求3所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變試劑盒，其特征在于，所述結合緩沖液的配方如下：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20。

6.根據權利要求2所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變試劑盒，其特征在于，所述退火緩沖液的配方如下：20mM pH 7.6 Tris-Acetate，2mM醋酸鎂。

7.一種焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取石蠟活檢標本組織中的基因組DNA；

(2)以步驟(1)中所得基因組DNA為模板，PCR擴增包含KRAS基因12和13密碼子核酸序列片段；

(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產物進行焦磷酸測序；

(5)測序得到SNP突變頻率。

8.根據權利要求7所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變的方法，其特征在于，步驟(2)中，

PCR擴增的體系為：10×PCR緩沖液5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO：4 5uL，模板DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加無菌水補足至50μL。

9.根據權利要求7所述的焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變的方法，其特征在于，步驟(2)中，

PCR擴增條件為：94℃5min；50個循環，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃終止反應。

10.權利要求1所述焦磷酸測序聯合擴增阻滯技術檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變引物在檢測KRAS基因12和13密碼子低頻突變中的應用。