[發(fā)明專利]一種可溶性重組蛋白及其表達(dá)純化方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710160147.0
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN107034226A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊惠英;劉潔;謝永生
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/01;C12N1/21;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣東廣信君達(dá)律師事務(wù)所44329
• 代理人: 楊曉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組蛋白，具體涉及一種可溶性重組蛋白及其表達(dá)純化方法和用途。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，自1991年在加拿大豬群中首次報(bào)道PMWS以來，該病已世界流行。而目前疫苗免疫接種是防控PCV2感染的有效手段。國內(nèi)外已經(jīng)商品化的疫苗主要有全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種，全病毒滅活苗，雖已有生產(chǎn)，但因體外培養(yǎng)增值能力不強(qiáng)，病毒滴度低，有時(shí)需要濃縮才能達(dá)到要求，且存在生產(chǎn)中批間質(zhì)量難統(tǒng)一等問題。相比之下，亞單位疫苗具有較好的安全性，并且免疫原性高，但同時(shí)存在表達(dá)量低且生產(chǎn)成本很高，難以在生產(chǎn)中使用該疫苗。因此尋找新的技術(shù)策略，提高亞單位疫苗的表達(dá)量是研制疫苗的關(guān)鍵。

圓環(huán)病毒(PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。研究表明PCV2含11個(gè)開放閱讀框(ORFs)，其中ORF2基因編碼病毒衣殼，唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白，也是主要免疫原性蛋白。PCV2Cap蛋白具有在體外自我組裝成病毒樣顆粒的特點(diǎn)。該病毒樣顆粒(Virus Like Particles，VLP)的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與天然的病毒粒子相同或相似，可通過與病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性，且無毒副作用。目前，已有部分VLPs疫苗上市，如流感VLPs疫苗、乙肝VLPs疫苗、乳頭瘤VLPs疫苗等，說明該類疫苗有巨大的潛力。

而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有產(chǎn)量高、生長速度快、操作簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合高密度發(fā)酵技術(shù)能有效提高重組大腸桿菌的菌體密度，增加重組蛋白的表達(dá)量，是非常經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)工藝。但大腸桿菌的高密度發(fā)酵表達(dá)的蛋白雜蛋白多，仍需進(jìn)一步純化來獲得目的蛋白。目前蛋白質(zhì)的純化主要依據(jù)相關(guān)蛋白質(zhì)的理化及生物學(xué)性質(zhì)不同將其與雜蛋白區(qū)分開來，對于Cap蛋白的純化，鹽析法、層析法(包括離子交換層析、疏水層析、反向?qū)游觥⒂H和層析)以及兩種及以上方法結(jié)合應(yīng)用較多。但層析法所用原料較貴且純化量小，耗費(fèi)人力物力較多，大大增加了制備成本，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET28a表達(dá)Cap蛋白，并通過高密度發(fā)酵技術(shù)大量培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白，同時(shí)利用兩步梯度鹽析沉淀法獲得純度較高，免疫原性好的Cap蛋白，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)量高、純化工藝簡便、成本低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，具有突出的推廣前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于解決現(xiàn)有PCV2病毒樣顆粒疫苗制備工藝復(fù)雜且成本高，處理量小，免疫原性差，不適于大規(guī)模生產(chǎn)等技術(shù)問題，由此本發(fā)明提供了一種可溶性重組蛋白，本發(fā)明還提供了所述可溶性重組蛋白的表達(dá)方法和純化方法，本發(fā)明還提供了所述可溶性重組蛋白在制備PCV2病毒樣顆粒疫苗的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種可溶性重組蛋白，所述可溶性重組蛋白是將豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的基因進(jìn)行原核表達(dá)得到的可溶性重組蛋白，所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的基因是使用大腸桿菌通用密碼子翻譯截短Cap蛋白氨基酸序列合成的基因，同時(shí)在該基因兩端分別添加5’BamHI和3’HindIII酶切位點(diǎn)，序列如SEQ ID NO:3。

本發(fā)明提供了一種載體，所述載體表達(dá)上述所述的可溶性重組蛋白。

本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述含有上述所述的載體。

本發(fā)明提供了一種上述所述的可溶性重組蛋白的表達(dá)方法，所述表達(dá)方法是將豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的基因進(jìn)行原核表達(dá)，所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述原核表達(dá)的載體是pET-28a載體。

優(yōu)選地，所述原核表達(dá)中采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為30℃。

本發(fā)明提供了一種上述所述的可溶性重組蛋白的純化方法，所述純化方法包括以下步驟：

(1)將表達(dá)所述可溶性重組蛋白的菌體破碎，分離收集上清液；

(2)采用兩步梯度鹽析沉淀法純化所述可溶性重組蛋白。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中菌體為大腸桿菌菌體。

優(yōu)選地，所述步驟(2)具體包括以下步驟：