[發(fā)明專利]一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710159593.X
• 申請(qǐng)日: 2017-03-17
• 公開（公告）號(hào): CN106645504A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜宏梁;張楊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢宏韌生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司32224
• 代理人: 薛海霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

熊去氧膽酸(ursodexycholic acid)是一種親水膽汁酸，在生理情況下，熊去氧膽酸占人體膽汁酸的比例不超過2％。研究表明，熊去氧膽酸能有效溶解膽固醇性結(jié)石，有利膽、保護(hù)肝細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)等作用，長(zhǎng)期服用能夠增加膽汁酸分泌，并使膽汁成分改變，降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂，有利于膽結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解，可明顯緩解癥狀，改善脂肪肝影像學(xué)表現(xiàn)，用于不宜手術(shù)治療的膽固醇結(jié)石，對(duì)脂肪肝具有較好療效，而且不良反應(yīng)輕，使用安全；對(duì)結(jié)腸癌化療引起的腹瀉、預(yù)防和治療肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)、各種肝病的輔助治療、膽汁返流性胃炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化的治療等有較好療效，被廣泛用于臨床多種肝膽疾病的治療。

由于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)法可以克服背景干擾，對(duì)復(fù)雜樣品仍可達(dá)到很高的靈敏度，且具有分辨率高、質(zhì)量范圍寬、掃描快等優(yōu)點(diǎn)，LC-MS/MS已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分。為此本發(fā)明建立了一種快速、靈敏的LC-MS/MS方法定量檢測(cè)人血漿中熊去氧膽酸的濃度，并將該方法應(yīng)用于熊去氧膽酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，為熊去氧膽酸的臨床研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。因此建立熊去氧膽酸的LC-MS/MS分析方法，有助于服務(wù)制藥企業(yè)，縮短其一致性評(píng)價(jià)的研究周期，高效嚴(yán)謹(jǐn)便捷準(zhǔn)確的進(jìn)行樣品分析。使老百姓吃到安全，有效又便宜的藥。

建立通用、簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的熊去氧膽酸血漿樣品分析定量檢測(cè)方法，有助于準(zhǔn)確快速的研究該化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，獲得相應(yīng)的PK參數(shù)，為熊去氧膽酸的一致性評(píng)價(jià)建立基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測(cè)方法，該方法采用沉淀前處理、LC-MS/MS質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單、分離效果好、定性準(zhǔn)確、樣品分析時(shí)間短、檢測(cè)靈敏度高。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：稱取熊去氧膽酸對(duì)照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為2～10mg·mL-1的熊去氧膽酸儲(chǔ)備液，將所述熊去氧膽酸儲(chǔ)備液用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成濃度為0.1～5000μg·mL-1的熊去氧膽酸工作溶液；稱取一定量的內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為0.300～0.800mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成200～600ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液；所有儲(chǔ)備液及工作溶液在0～10℃下保存，備用；

(2)血漿樣品前處理過程：取20.0～60.0μL人血漿樣品，向樣品中加入步驟(1)所述的內(nèi)標(biāo)工作溶液，然后加入乙腈沉淀劑，渦旋混合，于3～8℃的離心機(jī)中高速離心3～5分鐘；取上清液并向上清液中加入體積比1:1的甲醇水溶液，渦旋混合3～5分鐘，進(jìn)行LC-MS/MS分析；

(3)標(biāo)準(zhǔn)及曲線配制過程：等量取步驟(1)所述各濃度熊去氧膽酸工作溶液，分別加入到犬空白血漿中渦旋混勻，配制成校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品，然后分別注入LC-MS/MS中進(jìn)行測(cè)定，以熊去氧膽酸和內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，以人血漿中熊去氧膽酸的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)LC-MS/MS測(cè)定過程：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人血漿樣品中的熊去氧膽酸濃度。

進(jìn)一步地，所述LC-MS/MS測(cè)定過程工作條件為：

a.液相色譜條件：色譜柱為UItimateXB C18；流動(dòng)相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸銨的水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫箱溫度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色譜柱平衡狀態(tài)時(shí)的柱壓：20.0～24.0MPa；洗脫方式為梯度洗脫；

b.質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，采用負(fù)離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓：-5000～-4000V；渦旋離子噴霧溫度：550～650℃；氣簾氣種類：30psi；碰撞池氣體：中級(jí)；霧化氣種類Gas1：40psi；輔助氣Gas 2：50psi；數(shù)據(jù)收集時(shí)間：3～6min。

優(yōu)選地，步驟(2)所述離心機(jī)轉(zhuǎn)速≥10000×g。

優(yōu)選地，所述LC-MS/MS測(cè)定過程中熊去氧膽酸的監(jiān)測(cè)離子對(duì)為391.2/391.2，每次掃描一個(gè)離子對(duì)時(shí)所停留的時(shí)間200msec，去簇電壓-137eV，碰撞能量-5.00eV。