[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長鏈二元酸的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710159587.4
• 申請日: 2017-03-17
• 公開（公告）號: CN107022513A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉東;江君君;胡志浩;李麗
• 申請（專利權(quán)）人: 河北美邦工程科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi),徐偉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明適用于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長鏈二元酸的方法。

背景技術(shù)

a,ω-長鏈二元酸是指含有10個(gè)以上碳原子的直鏈二元羧酸。它是一類用途很廣的重要精細(xì)化工原料，廣泛應(yīng)用于芳香劑、防腐劑和聚合物等。

a,ω-長鏈二元酸在自然界不存在，目前根據(jù)長鏈二元酸的不同碳原子個(gè)數(shù)有兩種方法進(jìn)行生產(chǎn)，一種是化學(xué)合成法，一種是生物發(fā)酵法。化工合成法主要是以石油原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化(Liu et al.,2011，Biomacromolecules，12:3291–3298)，但是采用化學(xué)法生產(chǎn)有其局限性，首先是化學(xué)合成法的條件苛刻、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)物產(chǎn)率低、危險(xiǎn)性大、易污源環(huán)境。微生物發(fā)酵法則相對來說條件比較溫和，而且污染較小。

關(guān)于微生物發(fā)酵法，目前有報(bào)道在利用煉油副產(chǎn)物如十二烷烴或其衍生物作為底物(W.Lu et al.,2010,Chem.Soc.,132,15451./P.Fickers et al.,2005,Biotechnol.Lett.,27,859.)，利用酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸。但是以煉油副產(chǎn)物十二烷烴或其衍生物作為底物會存在供給限制，而且原料不可持續(xù)性，而且酵母生長和發(fā)酵周期長，增大了成本，產(chǎn)物多樣性比較差，因此尋找或構(gòu)建一些發(fā)酵周期短，生產(chǎn)工藝簡單微生物或重組菌株利用可持續(xù)性原料進(jìn)行此類發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。

目前也有在大腸桿菌中通過表達(dá)ω-羥化酶，如食油假單胞來源alk系列單氧酶(Manfred Schrewe et al.,Catal.2011,353,3485–3495)或者細(xì)胞色素P450系列單氧酶(Sumire Honda Malca et al.,Commun.,2012,48,5115–5117)等，將添加的底物脂肪烴、脂肪酸酸或者脂肪酸甲酯等轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羥基化產(chǎn)物，如果產(chǎn)物是ω-羥基脂肪酸則可以在醇還原酶和醛還原酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為a,ω-二元酸。大腸桿菌生長周期比酵母短，但是這種轉(zhuǎn)化方式需要外源添加底物，而且不同鏈長脂肪烷烴或其衍生物進(jìn)入細(xì)胞困難，雖然也有通過表達(dá)外膜蛋白alkL基因(Mattijs K et al.,2012,Applied and Environmental Microbiology,5724–5733)提高脂肪酸甲酯的細(xì)胞輸入，但是相對來說產(chǎn)率還是比較低。因此如何能讓細(xì)胞自行進(jìn)行相應(yīng)鏈長脂肪烷烴或其衍生物的合成，進(jìn)而進(jìn)一步在胞內(nèi)通過末端羥化酶進(jìn)行氧化是本領(lǐng)域技術(shù)人員研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長鏈二元酸的方法，即在基因工程微生物中利用可持續(xù)碳源實(shí)現(xiàn)長鏈二元酸的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種重組大腸桿菌菌株，所述重組大腸桿菌菌株是通過敲除或弱化了大腸桿菌中的脂肪酸β-氧化降解的路徑基因獲得的。

本發(fā)明提供的另一個(gè)目的是提供一種由上述重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)長鏈二元酸的方法，所述的方法是通過所述重組大腸桿菌菌株利用可持續(xù)性碳源積累得到長鏈脂肪酸，并進(jìn)一步將所述長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化得到長鏈二元酸。

具體的，所述方法通過在所述重組大腸桿菌菌株中表達(dá)長鏈脂肪酸的合成基因以及調(diào)控基因得到所述的長鏈脂肪酸。

更為具體的，所述長鏈脂肪酸的合成基因?yàn)榫哂行蛄斜碇蠸EQ ID NO:1核苷酸序列的加州月桂來源的硫酯酶fatB基因。

更為具體的，所述長鏈脂肪酸的調(diào)控基因?yàn)榇竽c桿菌來源的fadR基因。

具體的，所述方法通過在所述重組大腸桿菌菌株中表達(dá)ω-羥化酶、醇還原酶和醛還原酶，從而將積累的所述的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化形成所述的長鏈二元酸。

更為具體的，所述的ω-羥化酶包括alkBFGT系列單氧酶和細(xì)胞色素P450羥化酶。

更為具體的，所述的醇還原酶為醇還原酶alkJ。

更為具體的，所述的醛還原酶為醛還原酶alkH。

具體的，所述的碳源為葡萄糖。