[發明專利]通過容錯性擴增解決等位基因擴增不平衡的方法

有效

• 申請號: 201710158920.X
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106987621B
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 劉湘;王雷;趙曉丹;蘭更欣;張興鵬;宋曉玲;張少影
• 申請（專利權）人: 北京博奧晶典生物技術有限公司;成都博奧晶芯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種解決由于“在待測等位基因的引物與模板結合區存在堿基序列不匹配情況”而導致的等位基因擴增不平衡的方法，包括如下步驟：通過改變原有PCR擴增條件來增強PCR擴增時引物的容錯性，從而解決等位基因擴增不平衡的問題；所述原有PCR擴增條件為：對所述待測等位基因進行PCR擴增，出現所述待測等位基因擴增不平衡情況時所采用的PCR擴增條件；

所述改變原有PCR擴增條件為如下中的任一種或任幾種：

(a)在對所述待測等位基因進行PCR擴增時，降低退火溫度；

(b)在對所述待測等位基因進行PCR擴增時，增加PCR緩沖液的離子濃度；

(c)在對所述待測等位基因進行PCR擴增時，增加引物序列的長度；

進行所述(a)、所述(b)或/和所述(c)時，以既能增強PCR擴增時引物的容錯性又能保證所述待測等位基因的特異性擴增為度；

所述(a)中，在已初步優化好的PCR擴增程序中，以梯度溫度遞減的形式逐步降低退火溫度，一直降至既能成功擴增與引物完全匹配的靶基因，也能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的退火溫度；所述已初步優化好的PCR擴增程序為能夠成功擴增與所述引物完全匹配的靶基因，但不能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的PCR擴增程序；

所述(b)中，在已初步優化好的PCR擴增體系中，以梯度濃度遞增的形式增加Mg²⁺濃度，一直增加至既能成功擴增與引物完全匹配的靶基因，也能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的Mg²⁺濃度；所述已初步優化好的PCR擴增體系為能夠成功擴增與所述引物完全匹配的靶基因，但不能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的PCR擴增體系；

所述(c)中，在已初步優化好的引物中，以2-3個堿基梯度遞增的形式增加用于擴增所述待測等位基因的原有引物對中與靶基因序列不完全匹配的引物的長度，一直增加至既能成功擴增與引物完全匹配的靶基因，也能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的引物長度；所述已初步優化好的引物為能夠成功擴增與所述引物完全匹配的靶基因，但不能擴增與所述引物不完全匹配的靶基因的引物；

所述待測等位基因為HLA基因；

所述待測等位基因為基因型分別為B*46:01:01和B*51:01:02的HLA-B基因；

用于擴增所述待測等位基因的原有引物對為由上游引物BF和下游引物BR組成的引物對；所述上游引物BF的序列如序列表中序列1所示；所述下游引物BR的序列如序列表中序列2所示；其中，所述上游引物BF與基因型為B*51:01:02的HLA-B基因不完全匹配；

所述方法是通過進行所述(a)或所述(b)或所述(c)來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題的；

當采用所述(a)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，所述退火溫度由65℃降至62℃，其余PCR擴增條件不變；

當采用所述(b)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，所述PCR擴增反應體系中Mg²⁺濃度由2.5mM升至5.5mM，其余PCR擴增條件不變；

當采用所述(c)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，將所述上游引物BF的5’末端增加5個堿基，其余PCR擴增條件不變；

當采用所述(a)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，用于擴增所述待測等位基因的引物對為所述原有引物對；所述PCR擴增體系中Mg²⁺濃度為2.5mM；所述PCR擴增體系組成如下：Mg²⁺濃度為2.5mM的1×PCR擴增緩沖液，終濃度為200μM的dNTP，終濃度為0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，終濃度為0.075U/μl的DNA聚合酶，基因組DNA，余量為水；所述PCR擴增反應程序如下：96℃3min；96℃25s，62℃50s，72℃1min，35個循環；72℃5min；12℃保存；

當采用所述(b)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，用于擴增所述待測等位基因的引物對為所述原有引物對；所述PCR擴增體系組成如下：Mg²⁺濃度為5.5mM的1×PCR擴增緩沖液，終濃度為200μM的dNTP，終濃度為0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，終濃度為0.075U/μl的DNA聚合酶，基因組DNA，余量為水；所述PCR擴增反應程序如下：96℃3min；96℃25s，65℃50s，72℃1min，35個循環；72℃5min；12℃保存；

當采用所述(c)的方式來解決所述待測等位基因擴增不平衡的問題時，所述上游引物BF的序列為序列表中序列3；所述PCR擴增體系組成如下：Mg²⁺濃度為2.5mM的1×PCR擴增緩沖液，終濃度為200μM的dNTP，終濃度為0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，終濃度為0.075U/μl的DNA聚合酶，基因組DNA，余量為水；所述PCR擴增反應程序如下：96℃3min；96℃25s，65℃50s，72℃1min，35個循環；72℃5min；12℃保存。