[發明專利]一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法及應用

在審

• 申請號: 201710158115.7
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106867999A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 馬金平;王娟
• 申請（專利權）人: 新疆肥力沃生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

1.一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，包括如下進行的步驟：

(1)預處理

取微生物發酵有機肥樣品，加入PBS緩沖液、浸泡、離心、收集沉淀，重復上述的操作步驟，至離心后上清液無色，棄上清液，收集沉淀物，記為沉淀物Ⅰ；

(2)提取

在沉淀物Ⅰ中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液，然后向上清液中加入枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振蕩混勻，于45-60℃水浴9-60分鐘，離心，棄上清液，記為上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在溫度低于25℃下使DNA復性，再次離心，取上清液，記為上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有總DNA。

2.根據權利要求1所述的一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，第一次加入PBS緩沖液的量相當于所述微生物發酵有機肥樣品體積的3-15倍，浸泡不少于5分鐘；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mL PBS溶液。

3.根據權利要求1所述的一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的體積比2-5：1-3，所述枯草桿菌蛋白酶的初始濃度為20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始濃度為0.1-0.2mol/L。

4.根據權利要求1所述的一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述上清液Ⅰ與加入的枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液體積比為1：10-20。

5.根據權利要求1所述的一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述裂解液與SDS溶液的體積比為20-50：30，所述沉淀物Ⅱ與所述裂解液的體積比為1：10-20。

6.根據權利要求1所述的一種簡單快速提取微生物發酵有機肥中總DNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述裂解液為Clelex-100。

7.一種簡單快速檢測微生物發酵有機肥的方法，其特征在于，以權利要求1-6任一項所得的上清液Ⅱ中總DNA為模板，采用特異性引物進行PCR擴增，所述特異性引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

8.一種簡單快速檢測微生物發酵有機肥的試劑盒，其特征在于，至少包括PCR擴增引物，所述PCR擴增引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

9.根據權利要求8所述的一種簡單快速檢測微生物發酵有機肥的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括枯草桿菌蛋白酶、細胞裂解液和SDS溶液。

10.根據權利要求9所述的一種簡單快速檢測微生物發酵有機肥的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PBS緩沖液。