[發明專利]一種應用CD45免疫熒光聯合CEP探針鑒定循環腫瘤細胞的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710157839.X
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106970224B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 葉倫;李雪梅;李倩;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/533;C12Q1/6841;C12Q1/6888
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明;徐曉琴

本發明屬于生物醫學臨床檢測領域，具體涉及一種應用CD45免疫熒光聯合CEP熒光原位雜交探針鑒定循環腫瘤細胞的試劑盒及其應用。所述試劑盒包括：固定液、2×SSC、0.3％NP?40/0.4×SSC、0.075M KCl溶液、CD45單抗和CEP探針混合液、DAPI復染劑、穿孔劑、封閉液和封片劑。本發明采用CD45免疫熒光抗體聯合CEP熒光原位雜交探針鑒定捕獲的循環腫瘤細胞，通過一步法完成了免疫熒光和熒光原位雜交檢測，克服了免疫熒光檢測和熒光原位雜交檢測聯合使用時存在相互干擾、檢測耗時較長的問題，一步法雜交孵育在2h內快速完成，大大減少了檢測時間，并且檢測結果觀察直觀。

技術領域

本發明屬于生物醫學臨床檢測領域，具體涉及一種應用CD45免疫熒光聯合CEP熒光原位雜交探針鑒定循環腫瘤細胞的試劑盒及其應用。

背景技術

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是指是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，因自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落釋放進入外周血循環的腫瘤細胞，大部分CTCs在進入外周血后發生凋亡或被吞噬，少數能夠逃逸并錨著發展成為轉移灶。近幾年CTCs在腫瘤診斷、治療和監控等方面的臨床表現逐漸嶄露頭角，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段，臨床應用價值極其顯著。與傳統的影像學診斷、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比，優勢顯著，可更加敏感地發現疾病的變化，更加科學、迅速的評價某一治療方案的效果。而且分離富集CTCs只需抽取患者少量外周血，對患者沒有副作用，因此可以高頻度的監測，達到實時監測疾病進展的目的。更為重要的是，CTCs可作為分析患者腫瘤生物學特征的實時樣本，可以發現患者的實時生物學變化，并根據結果及時調整治療方案，實現實時的個體化治療。

CTCs富集捕獲的方法基本上基于以下三種原理：免疫捕獲、細胞大小、其他特征的識別(如細胞密度、電荷、形變能力等)，前兩種是目前應用較多的方法。捕獲后對CTCs鑒定是實現CTCs運用于臨床腫瘤患者的療效實時評估、病情實時監測、指導用藥和預后判斷的關鍵。鑒定CTCs最常用的方法主要有6種方法：(1)免疫熒光法；(2)流式細胞法；(3) 熒光原位雜交法；(4)RT-PCR；(5)基因芯片法；(6)二代測序法。免疫熒光法和流式細胞法基于CTCs膜蛋白特征鑒定技術；熒光原位雜交法、RT-PCR、基因芯片法和二代測序法基于CTCs核酸特征鑒定技術。

免疫熒光是利用抗原與抗體特異性結合的原理，使熒光素標記的抗體與特異的腫瘤標志物(主要包括上皮細胞角蛋白、上皮細胞膜特異性抗原等)結合，通過酶和底物反應顯色來判斷腫瘤細胞的存在。免疫熒光是檢測CTCs的成熟方法之一，簡便、直觀并可以進行形態學分析，但其敏感性只有10⁵左右，而且許多分化差的腫瘤不能表達目標抗原，而非上皮細胞中細胞角蛋白和上皮細胞抗原亦可能陽性，加之鏡下對結果觀察和判讀的主觀性較強，這些都限制了免疫熒光在CTCs檢測中的應用。

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。FISH 的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以用探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。熒光原位雜交技術在應用于檢測CTCs染色體多倍體，基因斷裂，基因融合時，由于捕獲的CTCs中存在大量的血細胞背景，在熒光顯微鏡下，尋找目標CTCs極為困難，從而限制了FISH技術在CTCs 中的應用。

發明內容