[發(fā)明專利]CPS1報告基因人肝細胞系及其構建方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710157350.2
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106947740A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發(fā)明（設計）人: 王韞芳;王怡;常樂
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司11322
• 代理人: 魯兵

1.CPS1報告基因人肝細胞系的構建方法，包括以下步驟：

1)構建攜帶靶向CPS1基因的單鏈向導RNA(sgRNA)編碼序列的骨架載體sgCPS1；

2)構建CPS1基因的打靶載體CPSLR-2A-tdTomato；

3)將骨架載體sgCPS1和打靶載體CPSLR-2A-tdTomato轉染到人肝細胞系中，經篩選獲得穩(wěn)定的tdTomato標記CPS1的CPS1-tdTomato報告人肝細胞系。

2.根據權利要求1所述的CPS1報告基因人肝細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟1)中用于構建骨架載體sgCPS1的工具載體包括px458、px330、px461和px333，優(yōu)選為pX458。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：以工具載體pX458為出發(fā)載體構建攜帶CPS1基因的單鏈向導RNA(sgRNA)的骨架載體，包括以下步驟：

1.1)設計靶向CPS1基因(GenBank號：1373)的sgRNA，根據CPS1 sgRNA序列獲得CPS1基因的靶標序列AGCTGTGCAGAAATCTCGCA(位于CPS1基因自5’端第4759-4778位堿基)，根據CPS1基因的靶標序列獲得CPS1 sgRNA編碼序列，在CPS1 sgRNA編碼序列兩端加上Bbs I酶切序列，最終獲得包含CPS1 sgRNA編碼序列的寡核苷酸序列如下：

oligo1:5’-CACCAGCTGTGCAGAAATCTCGCA-3’(帶下劃線堿基為Bbs I酶切序列)，

oligo2:5’-TTTGACGCTCTAAAGACGTGTCGA-3’(帶下劃線堿基為Bbs I酶切序列)；

1.2)將合成的包含CPS1 sgRNA編碼序列的寡核苷酸oligo1和oligo2進行退火并磷酸化；

1.3)將工具載體pX458用BbsI進行酶切，回收、純化酶切工具載體pX458；

1.4)將退火及磷酸化的包含CPS1 sgRNA編碼序列的寡核苷酸oligo1和oligo2連入經酶切的工具載體pX458中；

1.5)將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細菌，涂布于Amp⁺培養(yǎng)平板，37℃孵育過夜(16-20小時)；

1.6)從生長出的單克隆細菌中提取重組質粒，得到攜帶CPS1 sgRNA編碼序列的重組骨架載體，命名為pX458-sgCPS1，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4.根據權利要求1或2或3所述的CPS1報告基因人肝細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟2)中用于構建CPS1基因打靶載體的出發(fā)載體為包含tdTomato的原核表達載體，包括但不限于pET-tdTomato、pQE-tdTomato、pUC-tdTomato等，優(yōu)選為pET32-tdTomato。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：以pET32-tdTomato為出發(fā)載體構建CPS1基因打靶載體，包括以下步驟：

2.1)獲得CPS1基因的左臂插入片段(CPSL)和右臂插入片段(CPSR)，左臂插入片段(CPSL)的核苷酸序列如序列表中序列2所示，右臂插入片段(CPSR)的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

2.2)用Kpn I和EcoR V對左臂插入片段(CPSL)及pET32-tdTomato載體進行雙酶切，將兩種雙酶切產物進行連接，將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細菌，涂布于Amp⁺LB培養(yǎng)平板，37℃孵育過夜(16-20小時)，挑選單克隆生長細菌提取重組質粒，得到攜帶左臂插入片段(CPSL)的重組載體，命名為pET32-CPSL-tdTomato；

2.3)用Hind III和Sal I對右臂插入片段(CPSR)及pET32-CPSL-tdTomato載體進行雙酶切，將兩種雙酶切產物進行連接，將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細菌，涂布于Amp⁺LB培養(yǎng)平板，37℃孵育過夜(16-20小時)，挑選單克隆生長細菌提取重組質粒，得到攜帶左臂插入片段(CPSL)和右臂插入片段(CPSR)的重組載體，命名為pET32-CPSLR-tdTomato，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。