[發明專利]一種弧菌外膜蛋白亞單位佐劑疫苗及規模化制備技術

在審

• 申請號: 201710156715.X
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106924725A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 陶家發;孫承文;賴迎迢;江小燕;羅霞;趙長臣;鞏華;劉春花;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61K39/39;A61P31/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種哈氏弧菌外膜蛋白亞單位佐劑疫苗，所述疫苗包括以下組分：哈氏弧菌外膜蛋白Ompk和Montanide ISA 763A佐劑。

2.根據權利要求1所述的哈氏弧菌外膜蛋白亞單位佐劑疫苗，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk與Montanide ISA 763A佐劑的比例為2:3。

3.根據權利要求2所述的哈氏弧菌外膜蛋白亞單位佐劑疫苗，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk的濃度高于1.5mg/mL。

4.一種制備權利要求1-3任一所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，該技術包括如下步驟：將哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液和Montanide ISA 763A佐劑，按2:3比例混合攪拌均勻，乳化，無菌灌裝，即得到疫苗成品。

5.根據權利要求4所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于，所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術包括如下步驟：

將20L哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液，加入4L pH7.0的無菌磷酸緩沖液，過濾除菌后加入油相罐，將滅菌后的Montanide ISA 763A佐劑36L，緩慢加入，攪拌速度50-100r/min。在攪拌混合30min后，乳化30min，在無菌條件下，灌裝制得疫苗成品。

6.根據權利要求5所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于：所述將哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液的制備包括如下步驟：

(1)工程菌一級種子制備

(2)工程菌二級種子制備

(3)高密度培養誘導外膜蛋白表達與工程菌體獲取

(4)外膜蛋白的提取與濃縮。

7.根據權利要求6所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于，所述工程菌一級種子制備包括如下步驟：工程菌接種營養瓊脂，30℃條件下培養24小時，挑菌苔接種300ml營養肉湯，在30℃，180r/min條件下，培養10小時，得到一級種子液。

8.根據權利要求7所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于，所述工程菌二級種子制備包括如下步驟：一級種子液,接種30L發酵培養基，在30℃條件下通氣攪拌培養10h，得到二級種子。

9.根據權利要求8所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于，所述高密度培養誘導外膜蛋白表達與工程菌體的獲取包括如下步驟：二級種子接種300L發酵培養基，30℃，200r/min，通氣量250L/min培養，培養4小時后補料，6小時開始升溫42℃誘導表達，每隔1h，取樣，測定菌液A600值，直到菌液A600開始下降，停止發酵；測定工程菌體生物量和目標蛋白表達情況；培養得到的工程菌液利用管式離心機離心(13500r/min)收集菌體,稱重、-20℃凍融12h以上。

10.根據權利要求9所述哈氏弧菌外膜亞單位佐劑疫苗的規模化制備技術，其特征在于，所述外膜蛋白的提取與濃縮包括如下步驟：外膜蛋白的提取與濃縮工程菌體融解、配制懸浮液，超聲波破碎4個循環；離心收集包涵體；用100L洗滌液洗滌1次，離心收集沉淀；加入包涵體溶解液，在28℃條件下，裂解2h以上，隨后離心收集上清液；切向流超濾收集濃縮液；脫鹽、蛋白質復性；測定蛋白質濃度和外膜蛋白的純度，-20℃保存。