[發(fā)明專利]一種氣-液界面暴露系統(tǒng)聯(lián)合高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測一氧化碳致細胞DNA損傷的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710156524.3
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN107064481B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 侯宏衛(wèi);張森;胡清源;陳歡;王安;劉勇
• 申請（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心;中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

1.一種氣-液界面暴露系統(tǒng)聯(lián)合高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測一氧化碳致細胞DNA損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細胞培養(yǎng)：將處于對數(shù)生長期的貼壁生長細胞以單細胞懸液接種在底部為滲透性濾膜的裝置中，然后將所述裝置在細胞培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)，使細胞在滲透性濾膜上單層生長；

2)細胞染毒：移除所述裝置中的細胞培養(yǎng)液，取出裝置并置于包含細胞染毒液和毒性氣體的染毒倉中，使得裝置中的滲透性濾膜底部與細胞染毒液接觸，同時滲透性濾膜上的細胞表面暴露于毒性氣體達1h，其中所述細胞染毒液與步驟1)中的細胞培養(yǎng)液相同，并且其中所述毒性氣體由空氣與一氧化碳組成且其中一氧化碳的濃度為>0且≤44.64mmoL/L，所述毒性氣體的流量為20mL/min；

3)免疫熒光標記：

3-1)從染毒倉中取出所述裝置，洗滌，然后置于托盤內(nèi)，向裝置內(nèi)的細胞中加入多聚甲醛進行細胞固定；

3-2)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入TritonX-100以使細胞通透；

3-3)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γH2AX抗體進行孵育；

3-4)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入免疫熒光標記的二抗進行孵育；

3-5)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細胞中加入DAPI進行染色；

3-6)洗滌所述裝置和托盤，保存；

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測：分別進行所述細胞的細胞核和γH2AX的熒光測定，以所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)檢測到的平均熒光強度來表征γH2AX的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述細胞以單細胞懸液接種于底部為滲透性濾膜的裝置中，然后在細胞培養(yǎng)液中于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述滲透性濾膜為滌綸膜，膜上小孔的孔徑為0.4μm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，在細胞接種之前，用細胞培養(yǎng)液或PBS將所述裝置在37℃下平衡1-2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述毒性氣體中一氧化碳的濃度為8.93-44.64mmoL/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中，所述細胞的細胞核和γH2AX的熒光測定分別在兩組不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長下進行；

其中，所述步驟3-4)中，免疫熒光標記的二抗為Alexa Fluor 488標記的二抗，并且所述步驟4)中，在通道一中以激發(fā)波長358nm和發(fā)射波長461nm進行細胞核的熒光測定，在通道二中以激發(fā)波長495nm和發(fā)射波長519nm進行γH2AX的熒光測定，以獲得通道一所識別的有效細胞的有效細胞核內(nèi)通道二所檢測的平均熒光強度，由此表征γH2AX的含量。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在兩個通道中，測量倍數(shù)為100倍，每孔分析和測定9個視野。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括，設置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對照組，從而在步驟4)中得到由非特異吸附引起的空白信號，由此從檢測到的熒光測定信號中扣除空白信號。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于，通過在步驟2)中設置多種包含不同濃度的一氧化碳的毒性氣體，進行所述方法，最后根據(jù)步驟4)獲得的γH2AX平均熒光強度和一氧化碳的濃度繪制劑量-效應曲線。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于，通過在步驟2)中使細胞在染毒倉中接觸包含相同濃度的一氧化碳的毒性氣體達不同時間，進行所述方法，最后根據(jù)步驟4)獲得的γH2AX平均熒光強度和接觸毒性氣體的時間繪制時間-效應曲線。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述毒性氣體經(jīng)過0.2μm濾膜過濾后進入所述染毒倉內(nèi)。