[發明專利]一種同步檢測5種西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其應用

有效

• 申請號: 201710155415.X
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106702029B
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 李莉;馮耿;王錫鋒;劉文文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 11333 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡敬紅

1.一種同步檢測CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR體系中，包含有如下特異性引物：

擴增CiLCV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

擴增CGMMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

擴增ZYMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

擴增MABYV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

擴增WMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′；

所述PCR體系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩爾比分別為3：4：4：3：3。

2.根據權利要求1所述的方法，所述的PCR體系總體積25μL，其中含有cDNA 2μL、10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mmol/L的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物分別為0.3μL、0.4μL、0.4μL、0.3μL、0.3μL。

3.根據權利要求2所述的方法，所述PCR擴增反應條件為：94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒、55℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40個循環；最后72℃延伸10分鐘。

4.根據權利要求1－3任一所述的方法在同步檢測農作物中五種西瓜病毒病原CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，所述農作物為西瓜。

6.一種檢測試劑盒，含有檢測CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種西瓜病毒的引物，其分別為：

擴增CiLCV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

擴增CGMMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

擴增ZYMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

擴增MABYV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

擴增WMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′；

所述檢測的PCR體系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩爾比分別為3：4：4：3：3。