[發明專利]一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因產生非同源性末端接合效率的方法

在審

• 申請號: 201710155251.0
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN106906242A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 周勇;申友鋒
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明涉及一種可以有效提高CRISPR/Cas9技術在敲除基因應用的方法，其特征在于：轉染CRISPR/Cas9載體的同時，共轉染本發明中涉及的小分子干擾RNA，可以有效提高CRISPR/Cas9系統靶位點形成的NHEJ的效率，具體包括如下步驟：

（1）設計pten基因的gRNA，每個基因3個靶位點，合成對應的oligo和用BbsI酶切過的PX458 載體進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽性菌落，提取陽性菌落質粒進行分析及測序，確認gRNA表達載體構建正確；

（2）將步驟（1）構建的gRNA載體與小干擾RNA共轉染轉染293T細胞，另取構建的gRNA載體轉染293T細胞（作為對照組）；

（3）將步驟（2）轉染24~48小時，細胞經流式分選，篩選出GFP標記的轉染陽性細胞；

（4）提取基因組，PCR擴增靶位點區域片段，將PCR產物退火，并用T7E1酶切，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行灰度分析（indel）檢測NHEJ效率，檢測結果發現共轉染小干擾RNA可以有效提高CRISPR/Cas9在靶位點形成NHEJ效率為3.39~7.8倍。

2.根據權利要求1所述的小分子干擾RNA，其特征在于：該小分子RNA具有有效下調人pten基因的表達功能。

3.根據權利要求1所述的小分子干擾RNA，其對應的RNA序列如序列表SEQ ID NO. 3-4、SEQ ID NO. 7-8和SEQ ID NO. 9-10所示。

4.根據權利要求1所述的小分子干擾RNA，為權利要求3所述的3條小分子RNA序列的等比混合物。

5.本發明涉及的小干擾RNA可以有效提高CRISPR/Cas9系統在293T細胞中靶向敲除人pten基因的NEHJ效率。

6.一種CRISPR/Cas9高效靶向敲除人pten基因的技術方法。