[發明專利]一種基于油滴生成技術的轉基因玉米高通量檢測方法

在審

• 申請號: 201710155043.0
• 申請日: 2017-03-14
• 公開（公告）號: CN106755548A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 李亮;李凱;宛煜嵩;董美;金蕪軍;劉衛曉;高進;王迪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 葉立濤,司麗春

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種基于油滴生成技術的轉基因玉米高通量檢測方法。

背景技術

轉基因作物的研制和管理是世界各國都非常關注的問題。我國同樣高度重視轉基因植物安全管理，2001年5月23日頒布了《轉基因生物安全管理條例》，之后國家質量監督檢驗檢疫總局等部門制定了《出入境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》加強對轉基因作物的監管力度。

轉基因檢測多以外源DNA為目標，檢測方法包括普通PCR、熒光定量PCR、southern雜交等技術。然而，基于PCR技術的檢測方法通常每管只能進行一對引物的反應，無法擺脫通量低的缺點。常規的多重PCR反應，由于一個反應管中的引物過多會產生相互的干擾并且產生引物多聚，會對靶標DNA的擴增產生干擾，有時還會出現假陽性的情況。基于芯片技術的檢測方法，可以實現高通量、高靈敏等要求，但對于轉基因特殊目標基因的檢測還需要對芯片進行特制，操作較為繁瑣。

發明內容

本發明基于油滴生成技術建立新型的多重PCR，實現多重靶標DNA的擴增，并于高靈敏度的毛細管電泳檢測技術相偶聯，提高轉基因多重檢測的檢測極限。本發明旨在利用本技術實現更大規模地篩選靶基因，進而對轉基因作物進行大范圍覆蓋。

一種基于油滴生成技術的轉基因玉米高通量檢測方法，按照如下步驟進行：

1)轉基因玉米基因組DNA模板的提取；

2)采用油滴生成器制備多重油滴；

3)多重油滴定性PCR反應；

4)多重油滴定性PCR擴增產物的純化；

5)多重油滴定性PCR擴增產物毛細管電泳分離；

6)毛細管電泳圖像采集；

7)進行多重樣品分析，獲得樣品最優結果。

所述步驟1)中的轉基因玉米基因組DNA提取是用TianGen Plant Genomic DNA Kit(Cat.#DP-305)試劑盒對轉基因玉米標準物質(AOCS,IRMM)進行提取。

所述步驟1)后可設置多重油滴PCR反應體系的優化；根據不同目的片段的大小以及相對引物的擴增效率進行優化，選出最優的反應體系以及反應條件。

所述步驟2)中油滴生成器采用Bio-Rad公司QX200Auto DG Droplet Digital PCR System，油包水反應體系大小均勻，直徑1nm。

所述步驟4)中多重油滴定性PCR擴增產物為油水混合物，采用TianGen公司Universal DNA Purification Kit(Cat.#DP214-02)試劑盒進行純化。

所述步驟5)對于多重油滴定性PCR反應純化產物進行毛細管電泳定量分離的儀器為Agilent 2100Bioanalyzer system。

所述步驟6)中毛細管電泳圖像采集方法為：采用Agilent 2100 Bioanalyzer system軟件對不同擴增產物閾值以及Maker進行設定，最終形成可見的峰圖電泳圖。

所述步驟7)中多重樣品分析：對于20-32種不同轉基因玉米目的片分為4組，分別進行4-6重油滴PCR，對于不同組進行分別優化，實現20-32種同時檢測。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明通過油滴生成技術，建立新型多重PCR反應，實現多重靶標DNA的擴增，并與高靈敏度的毛細管電泳檢測技術相偶聯，提高轉基因多重檢測的檢測極限。本發明旨在利用本技術實現更高大規模地篩選靶基因，進而對轉基因作物進行大范圍覆蓋。本發明提供基于油滴生成技術對轉基因玉米進行高通量檢測的方法，包括轉基因玉米材料挑選、多重油滴PCR擴增、產物的純化和毛細管電泳及圖像采集分析。

附圖說明

圖1是提取的樣本DNA定性PCR產物電泳圖(編號1-11)；

圖2是提取的樣本DNA定性PCR產物電泳圖(編號1-12)；

圖中，M：100bp Maker；1-22：59122、MIR162、NK603、BVLA430101、ZSSIIb、CaMV35S、MIR604、T-NOS、C0030.3.5、MON89034、C0030.3.7、SK12-5、Bt176、NPTII、4114、T25、MON810、MON87460、MON863、bar、TC1507、Bt11特異性片段；

圖3是毛細管電泳圖像；

圖4是毛細管電泳圖像；

圖中，L：Ladder；1-12：多重PCR結果，12個重復。

具體實施方式