[發明專利]一種針對cfDNA的單鏈DNA二代測序文庫構建方法

有效

• 申請號: 201710153542.6
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN106987585B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 溫媛;劉明;王一杏;毛燕
• 申請（專利權）人: 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 陳劍聰

1.一種針對cfDNA的單鏈DNA二代測序文庫構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)cfDNA提取；

2)提取的cfDNA在磷酸酶的作用下去磷酸化；去磷酸化反應體系包括：SAP1μl；SAP緩沖液2μl；cfDNAxμl，0＜x＜20；ddH₂O加至總20μl；反應條件為37℃反應30-60min，然后65℃反應15-30min進行磷酸酶的滅活；

3)變性處理：95±2℃高溫處理，將原來雙鏈的cfDNA變性為單鏈cfDNA；

4)3’端接頭連接：在步驟3)所得的單鏈cfDNA產物和3’端單鏈DNA接頭進行分子間的單鏈連接；連接反應的連接酶是TS2126RNA ligase 1；連接反應體系包括：單鏈cfDNA產物，1-5倍摩爾濃度的3’端接頭量，5-15Vol％的PEG6000，25mM ATP，2.5mM MnCl₂，RNA ligase 1緩沖液，0.1mg/ml的TS2126 RNA ligase1；連接反應的反應條件為65℃反應1-2.5h；3’端接頭序列5'PHO-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'ddC,該接頭序列5'端磷酸化修飾，3'端雙脫氧修飾；

5)延伸：在步驟4)所得的單鏈連接產物為模板，3’端接頭已知序列設計引物進行延伸，獲得雙鏈DNA產物；

6)5’端接頭連接：在步驟5)獲得的雙鏈DNA產物和5’端雙鏈DNA接頭進行分子間的雙鏈連接；連接反應的連接酶為T4DNA ligase；5’端接頭的上鏈序列為

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

下鏈序列則是上鏈序列的反向互補，上鏈序列的T是突出末端；

7)PCR擴增：以步驟6)獲得的完整雙鏈DNA接頭連接產物為模板，以3’端和5’端兩端接頭已知序列為正反向引物，進行PCR擴增；

8)用磁珠法進行PCR產物純化，回收文庫。