[發明專利]用于檢測副豬嗜血桿菌的LAMP引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201710150721.4
• 申請日: 2017-03-14
• 公開（公告）號: CN108570510B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 丁軻;李藝璇;余祖華;王國杰;邱靜靜;趙戰勤;汪洋;李旺;李元曉;何萬領;張春杰
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.用于檢測副豬嗜血桿菌HPS 4型的LAMP引物，其特征在于：包括外引物LPS-F3/LPS-B3和內引物LPS-F1C-F2/LPS-B1C-B2，引物序列如下所示：

LPS-F3：5’-TGTTGCAGCTTGCTGTAGTC-3’，

LPS-B3：5’-AACGCATCTGTTCGTTATTCT-3’；

LPS-F1C-F2：

5’-AGTCTGATCACCTTGTATAATATCCCAGATTTGAGAATGCAATGTTTACA-3’，

LPS-B1C-B2：

5’-GTATGGAAATGAATTATCCTTCTGAGGAACGATTACCTTGCTTAACACTA-3’。

2.包含如權利要求1所述LAMP引物的試劑盒。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：還包含2×LAMP Buffer、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和無菌超純水。

4.一種非診斷目的檢測副豬嗜血桿菌HPS 4型的LAMP方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）以樣品基因組DNA為模板，利用特異性LAMP引物進行環介導等溫擴增反應；

2）反應結束后，在反應液中加入熒光顯色劑染色或者取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷樣品中是否含有副豬嗜血桿菌HPS 4型；

步驟1）中特異性LAMP引物包括外引物LPS-F3/LPS-B3和內引物LPS-F1C-F2/LPS-B1C-B2為，引物序列如下所示：

LPS-F3：5’-TGTTGCAGCTTGCTGTAGTC-3’，

LPS-B3：5’-AACGCATCTGTTCGTTATTCT-3’；

LPS-F1C-F2：

5’-AGTCTGATCACCTTGTATAATATCCCAGATTTGAGAATGCAATGTTTACA-3’，

LPS-B1C-B2：

5’-GTATGGAAATGAATTATCCTTCTGAGGAACGATTACCTTGCTTAACACTA-3’。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟1）中環介導等溫擴增的反應體系為：以25μL體系為標準，2×LAMP Buffer 12.5μL，50mM MgSO₄ 1μL，8000U/mL Bst DNA聚合酶1μL，25mM dNTPs 2μL，20pM外引物LPS-F3/LPS-B3各0.2μL，20pM內引物LPS-F1C-F2/LPS-B1C-B2各0.8μL，10~50pM DNA模板0.5μL，無菌超純水補足至25μL。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟1）中環介導等溫擴增的反應條件為：溫度62℃，時間40min；80℃滅活10min。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟2）中當加入熒光顯色劑SYBR Green I染色時，采用直接目測法判斷樣品中是否含有副豬嗜血桿菌HPS 4型，具體操作為：在反應液中加入SYBR Green I，染色后觀察結果；在正常日光下，反應液呈綠色的為陽性反應，呈橙色的為陰性反應。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟2）中當取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測時，根據電泳結果判斷樣品中是否含有副豬嗜血桿菌HPS 4型，具體操作為：取反應液于瓊脂糖凝膠中電泳，紫外儀中觀察結果：呈梯狀條形帶的為陽性反應，無梯狀條形帶的為陰性反應。