[發明專利]一株分泌抗平足蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201710150482.2
• 申請日: 2017-03-14
• 公開（公告）號: CN106947744B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 汪世華;楊清海;謝成杰;陳惠玲;王榮智;凌素美;曾林茂;肖詩偉
• 申請（專利權）人: 福州邁新生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/574;C07K19/00
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;陳彩芳

本發明提供一株分泌抗平足蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，還提供了一種分泌的可特異性識別人平足蛋白（Podoplanin，PDPN）的單克隆抗體，目的是提供一種將該抗體用于多種腫瘤免疫學診斷的應用方法。PDPN蛋白是一個38 kD O?鏈接的橫跨膜唾液酸糖蛋白，通常用于標記組織中的淋巴管內皮，制備該抗體的抗原為一段優選的、由大腸桿菌表達、具有免疫原性活性的重組蛋白，最終獲得的抗體屬于IgG2b亞型，對多種腫瘤組織的免疫組織化學檢測發現，該抗體可以很好的鑒別腫瘤的發生，可用于這些腫瘤的免疫學診斷。

技術領域

本發明涉及一種可以識別人平足蛋白的單克隆抗體及可分泌該抗體的雜交瘤細胞系。具體而言，本發明提供了一種抗腫瘤細胞表面抗原PDPN的單克隆抗體，該抗體可以用于通過人工或自動化方式，以免疫組織化學染色（IHC）、酶聯免疫吸附（ELISA）或免疫印跡（Western Blot）方式檢測細胞中PDPN的表達水平，從而對這些腫瘤進行診斷，屬于生物檢測領域。

背景技術

PDPN蛋白又稱腎小球上皮細胞整合膜蛋白，1996年由Wetterwald首次發現并報道，而后Breiteneder等發現其還存在于小鼠的腎小球足狀突細胞膜表面蛋白，與維持腎小球通透性及足狀突細胞突起的形成有關。在Breiteneder等的進一步研究中發現，PDPN特異性表達于淋巴管，而不表達于血管，可作為淋巴管內皮標記物。

PDPN蛋白是一種相對分子量為38 kDa的Ⅰ型跨膜唾液酸糖蛋白，由162個氨基酸組成，可分為4個部分：第一部分為第1位至第22位氨基酸組成的信號肽片段，第二部分為第23位至第131位氨基酸編碼的胞外片段，第三部分為第132位至第152位氨基酸編碼的跨膜片段，第四部分為第153位至第162位氨基酸組成的胞漿片段。

PDPN蛋白不只在淋巴管內皮表達，也在人體很多組織細胞表達，如腎足突細胞、骨骼肌、肺、心臟和乳腺的肌成纖維細胞、唾液腺、成骨細胞、卵巢粒層細胞、濾泡樹突狀細胞和間皮細胞等。近年來，越來越多研究發現在多種人類腫瘤中PDPN表達由無到有或表達上調，包括口腔鱗癌、喉癌、肺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、膀膚癌、食管癌、結直腸癌、皮膚癌、淋巴瘤、牙源性細胞瘤、卵巢無性生殖細胞瘤及粒層細胞癌、間皮瘤等，另外在一些中樞神經系統腫瘤中的表達也上調。

自從發現PDPN以來，針對它在淋巴管形成，炎癥的發生以及腫瘤的發生發展中的作用的研究越來越多，隨之產生各種抗PDPN的單克隆抗體。D2-40是最早制備的抗PDPN抗原的單克隆抗體，現在已用于病理診斷，診斷腫瘤患者的淋巴管轉移；NZ-1抗體能夠抑制PDPN誘導的血小板聚集；18H5現在已經商品化用于ELISA，western blot，FCM 等技術。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種制備PDPN重組蛋白的方法，該重組蛋白由PDPN分子的胞外區片段及用于純化的組氨酸標簽組成。

本發明的第二個目的是提供一種特異性好，親和力高的PDPN單克隆抗體，該抗體能特異結合PDPN重組抗原和天然抗原。

本發明的第三個目的是提供一種將本抗體用于腫瘤組織切片免疫組織化學檢測的使用方法。

解決技術問題所采用的技術手段

本發明對PDPN分子按照公布的序列進行分析，依據在細胞膜上的結構、抗原性、組成氨基酸的親疏水性以及二級結構，選擇適宜可溶表達又具有良好免疫原性的區域用于重組表達。為促進重組蛋白的可溶表達，優化其表達行為，對片段進行密碼子優化，經基因合成后克隆進表達載體pET-28a中重組表達，純化目的蛋白后作為免疫原，多次免疫Balb/c小鼠。經細胞融合、篩選和亞克隆，獲得高效分泌抗PDPN抗體的單克隆細胞系。