[發明專利]眼鏡蛇毒細胞毒素-4N的純化制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201710148111.0
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN107098956B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 張學榮;孫林;羅小玲;廖明;班建東;蔡鳳桃;陳纓;農君;王秀南;余雷
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C07K1/18;C07K1/16;C07K1/14;A61K38/17;A61P1/16
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了一種眼鏡蛇毒細胞毒素?4N的純化制備方法，先采用DEAE?SepharoseCL?6B陰離子交換柱然后再利用SephadexG?50凝膠層析柱、Macro?prep High S陽離子交換柱依次進行分離，每次分離后選取眼鏡蛇毒細胞毒素?4N活性最高的峰作為下步分離的樣品。研究表明，應用本發明可以獲得電泳純度的CTX?4N，其純度高，活性高；HSC?T6增殖抑制和凋亡實驗證明，CTX?4N對HSC?T6細胞有殺傷作用，提示肝纖維化發展過程CTX?4N會有抗肝纖維化的作用，具有重要的藥用價值。

技術領域

本發明屬于眼鏡蛇毒細胞毒素領域，尤其涉及一種眼鏡蛇毒細胞毒素-4N(CTX-4N)的純化制備方法及其應用。

背景技術

眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的毒液，其化學成分復雜，含有多種蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質，具有廣泛的生物活性。眼鏡蛇細胞毒素(Cytotoxin，CTX)又稱眼鏡蛇心臟毒素(Cardiototxin)，是眼鏡蛇毒的重要活性物質之一，約占蛇毒蛋白25％～40％，具有心臟毒、抑制骨吸收、引起可興奮組織去極化、抗菌等生物活性，并誘導多種腫瘤細胞凋亡，不同區域不同蛇種蛇毒中含有組分的生物效應不盡相同。

從眼鏡蛇中分離純化CTX是研究其理化性質、毒性反應、藥理作用、作用機制等的必要前提。在分離純化CTX方面，國內外學者大都采用陽離子交換柱層析和凝膠過濾相結合的方法進行分離純化，據此發現了CTX-I，CTX-II，CTX-III，CTX-IV(SEQ.ID.No.2)，CTX-V等細胞毒素，然而，此種方法中，由于柱效的影響因素繁多，且很難加以控制，故重復性差，分離純化后所得產品中往往含有其他蛋白物質，從而將影響細胞毒素生物活性的研究。

肝纖維化是慢性肝病損傷后，肝臟自我修復的一個過程`，造成肝纖維化的原因是大量的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝臟內沉積，改變了肝臟的結構，破壞了肝臟的生理功能；而使ECM過多的在肝臟累積的原因是肝星狀細胞HSC的激活，激活的HSC細胞會產生大量的ECM；過多的ECM會使肝臟發生纖維化，繼續發展為肝硬化，肝功能衰竭等疾病。因此在肝纖維化的過程中HSC細胞有至關重要的作用，如何抑制其激活或者使其發生凋亡在抗肝纖維化過程中有著重大關聯。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種簡單、高效、可控的眼鏡蛇毒細胞毒素-4N的純化制備方法及其應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

眼鏡蛇毒細胞毒素-4N在制備抗肝纖維化藥物中的應用。

上述眼鏡蛇毒細胞毒素-4N按以下方法制備：先采用DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱然后再利用SephadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱依次進行分離，每次分離后選取眼鏡蛇毒細胞毒素-4N活性最高的峰作為下步分離的樣品。

選取眼鏡蛇毒細胞毒素-4N活性最高的峰采用CCK-8實驗方法，通過對HSC-T6細胞增殖抑制作用，用超純水對所收集的各峰稀釋后進行檢驗。

眼鏡蛇毒細胞毒素-4N的純化制備方法，包括以下步驟：

(1)DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱洗脫分離；

(2)SephadexG-50凝膠層析柱洗脫分離；

(3)Macro-prep High S陽離子交換柱洗脫分離。