[發明專利]一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法

有效

• 申請號: 201710147935.6
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN106868035B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 孫九如;史小月;柏偉;范志和
• 申請（專利權）人: 上海賽倫生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/21
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，該方法由如下步驟組成：

(1)將如SEQ ID NO:2所示的經過密碼子優化的編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列構建入酵母細胞誘導表達載體中；

(2)轉入酵母細胞采用YPD培養基進行培養后誘導表達；

(3)進行純化，從而獲得所述重組馬Interferon-alpha-1；

所述酵母細胞是畢赤酵母細胞。

2.根據權利要求1所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，所述畢赤酵母細胞是GS115細胞。

3.根據權利要求1所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述酵母細胞誘導表達載體是分泌表達載體，其所用的啟動子為AOX1啟動子，在步驟(2)所述誘導表達后，細胞培養上清中含有所述重組馬Interferon-alpha-1。

4.根據權利要求3所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，所述分泌表達載體是畢赤酵母表達載體，具體為pPIC9表達載體，載體轉染入畢赤酵母細胞后與酵母染色體重組整合入酵母染色體中。

5.根據權利要求4所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體為，密碼子優化的馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列在5’端加上XhoI位點和AAAAGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位點；選用pPIC9質粒，用XhoI和EcoRI雙酶切使之線性化；將具有XhoI和EcoRI酶切獲得的馬Interferon-alpha-1DNA與XhoI和EcoRI線性化的pPIC9質粒連接，然后轉化大腸桿菌菌株DH5ɑ獲得pPIC9-Interferon-alpha-1表達載體。

6.根據權利要求1所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述誘導表達通過甲醇誘導；所述誘導表達在培養液的OD₆₀₀達到20-400時啟動。

7.根據權利要求3所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，所述細胞培養上清分離方法為離心分離或壓濾。

8.根據權利要求1所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，步驟(2)具體為：在長有畢赤酵母細胞GS115的YPD平板上挑取單克隆細胞接種到含YPD培養基的容器中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養過夜；取部分過夜的培養細胞接種到含YPD培養基的容器中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養至OD₆₀₀＝1.3-1.5；培養液離心，棄上清；細胞重懸，離心棄上清；線性化pPIC9-Interferon-alpha-1表達載體加入到重懸的GS115細胞中混勻后，在電轉儀上脈沖電擊細胞一次；電擊后立即加入冰凍1M山梨醇，并轉移到離心管中；取部分涂布到RDB板上，RDB板置28-30℃培養5-7天；挑取克隆，同時接種在MD培養板和MM培養板上，置28-30℃培養；挑取生長正常的克隆接種在含YPD培養基的容器中培養并誘導表達，培養后，采樣離心，取上清液進行SDS-PAGE電泳分析。

9.根據權利要求1所述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述純化方法為細胞培養上清通過離子交換層析柱層析方法將所述重組馬Interferon-alpha-1以單體形式分離。