[發明專利]普通小麥中維生素B2含量的高效液相色譜測定方法

在審

• 申請號: 201710146557.X
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN106645519A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 張艷;李婕筠;何中虎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,王春霞

技術領域

本發明涉及一種普通小麥中維生素B2含量的高效液相色譜測定方法。

背景技術

小麥是世界第二大糧食作物，在全球各地廣泛種植。我國是小麥生產和消費量最大的國家，2016年小麥種植面積達到24186.5千公頃，總產量約為1.29億噸。隨著經濟和社會的發展，消費者的生活需求正在發生變化，小麥營養品質備受關注。B族維生素是維持人體生命活動必需的一類有機物質，特別是維生素B2與心血管疾病、口角炎、唇炎和皮膚炎等疾病密切相關。由于人類和動物自身不能合成維生素B，必須從外界攝取，而谷類食物既富含維生素B族成分又是人們重要的日常食物來源，因此準確測定小麥面粉中維生素B2的含量對評價小麥營養價值及品質育種具有重要的指導性意義。

現階段，維生素B2的檢測方法包括國際上的微生物法和國標的熒光分光光度計法。其中，微生物法定量結果準確，但前處理步驟繁瑣，培養時間長，技術難度大，重復性差；熒光分光光度計法操作簡單，但由于谷物中維生素B含量較低，有共存物質干擾，所以檢測結果重復性不高。鑒于人們對于B2的深入研究，此類方法已不能滿足研究者的要求。目前，液相色譜法因其分離效率高、速度快、檢測靈敏度高、載液流速快、重復性好、對環境污染小、受環境條件影響小等優點被廣泛使用。國內測定麥類作物中B2含量的研究已有報導，但不同研究者方法不盡相同，提取方法和色譜條件是影響測定結果的重要原因。

提取方法是定量分析的最重要的環節，提取溶劑及方法會影響終產物的產量和質量，進而干擾后續的定量分析。目前，對維生素B族成分的提取因試驗材料和儀器不同而沒有統一的提取標準。韓豪等提取黑小麥中維生素B2時，對黑小麥使用脫脂處理，樣品用量大；王海燕等通過高峰淀粉酶法提取彩色小麥中維生素B2，操作復雜，需精確調節每個樣品的酸堿度，對大批量樣品測定費時費力。同時上述方法需要在加熱條件下操作完成，但小麥中淀粉含量較高，高溫會使淀粉糊化而降低維生素的溶出率。

高效液相色譜(HPLC)技術能對維生素進行快速、靈敏、準確的測定，并通過改變檢測器和檢測波長提高儀器靈敏度。大量研究利用HPLC技術測定蔬菜、水果、肉類、飲料及乳制品中的維生素含量，但普通小麥中維生素B2的測定研究較少。Batifoulier等利用HPLC測定小麥中維生素B2的含量，測定B2的色譜柱為μBondapak C18(150mm×3.9mm)，該色譜柱實驗成本較高。匙贏贏等利用HPLC結合紫外檢測器測定麥麩中維生素B2的含量，由于受基體干擾，紫外檢測器檢測時會出現靈敏度和選擇性下降等問題。

目前，我國對維生素B的定量研究主要集中于彩色小麥，其分析樣本量較少，沒有統一的測定標準，無法為普通小麥維生素B含量的分析打下基礎。因此，確立高效準確的維生素B2提取和檢測方法，可以為普通小麥維生素B的遺傳研究提供可靠的表型鑒定方法。

發明內容

本發明的第一個目的是提供普通小麥中維生素B2的提取方法。

本發明所提供的普通小麥中維生素B2的提取方法，包括如下步驟：

將普通小麥制成全麥粉，所述全麥粉在醋酸鈉水溶液中進行酶解；所述酶解結束后的體系經過濾得濾液，即得到維生素B2。

所述維生素B2的提取方法中，所述酶解采用復合酶，所述復合酶可為木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶和還原性谷胱甘肽的復合物。

所述復合酶的用量為：所述全麥粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶與所述α-淀粉酶的質量比可為2.5：0.05～0.1g：0.01～0.02g：0.005～0.01g，所述全麥粉與所述還原性谷胱甘肽的用量比為2.5g：250～500μl；

所述全麥粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的質量比具體可為2.5g：0.05g：0.01g：0.005g，所述全麥粉與所述還原性谷胱甘肽的用量比具體可為2.5g：250μl。

所述木瓜蛋白酶的酶活為6000U/mg(如北京索萊寶科技有限公司提供的木瓜蛋白酶，貨號為LS003126)，所述酸性磷酸酶的酶活≥0.4U/mg(如Sigma-Aldrich公司提供的酸性磷酸酶，產品目錄號為P3627)，所述α-淀粉酶的酶活為30U/mg(如Sigma-Aldrich公司提供的α-淀粉酶，產品目錄號為10065)。

所述酶解可采用恒溫酶解的方式，溫度可為36～38℃，具體可為37℃，時間可為16～18h，具體可為18h，可在轉速為180rpm的條件下進行。