[發(fā)明專利]一種缺失ompA基因鴨疫里默氏桿菌CH3減毒菌株的構(gòu)建方法

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• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN108220213A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋玉軍;李航;崔俊生;蘇軍;吳遠(yuǎn)航
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽安龍基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 王桂名

1.一種缺失ompA基因鴨疫里默氏桿菌CH3減毒菌株的構(gòu)建方法，具體步驟為：

（1）、培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌CH3株及提基因組：

制備基因組模板：從-80℃冰箱取凍存的RA CH3株，在TSA平板復(fù)蘇，在5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，將挑菌種轉(zhuǎn)接至4ml TSB液體培養(yǎng)基中后，放置37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)1-4小時后，放37 ℃震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，后離心收集菌體，根據(jù)基因組試劑盒中的說明書的操作步驟制備CH3株的基因組；

（2）、Riemerella anatipestifer CH3株ompA基因同源臂及抗性spec基因片段的克隆：

a:以RA CH3基因組為模板，以ompA-L F/ompA-L R 以及ompA-R F/ompA-R R為引物PCR分別擴(kuò)增ompA基因的左右側(cè)片段作為同源重組的同源臂，將目的片段連接pGEM-Teasy載體中轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定陽性質(zhì)粒，命名pT-ompA-L、pT-ompA-R并進(jìn)行測序；

b:壯觀霉素抗性基因（Spc）的擴(kuò)增：有合適的抗性標(biāo)記，突變株才可以篩選,在G-菌中壯觀霉素抗性基因可以正常表達(dá)，并且RA對Spc抗性敏感,用上海獸醫(yī)研究所胡青海實(shí)驗(yàn)室保存的pFW5質(zhì)粒為模板，用引物spec F /R擴(kuò)增Spc基因表達(dá)盒，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠回目的片段連接到pGEM-T-easy載體上，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定陽性質(zhì)粒，命名pT-Spc并進(jìn)行測序；

（3）、重組質(zhì)粒pT-ompA-LSR的構(gòu)建：

提取重組質(zhì)粒pT-ompA-L、pT-ompA-R、pT-Spc，對pT-ompA-L重組質(zhì)粒用BamHI和MscI雙酶切，對pT-ompA-R重組質(zhì)粒用SphI和XhoI進(jìn)行雙酶切，對pT-Spc重組質(zhì)粒用MscI和XhoI進(jìn)行雙酶切，37℃水浴，2.5h后，用瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的片段切下，用膠回收試劑盒純化，酶切反應(yīng)體系如下：

雙酶切體系： BamHI 1ul

MscI 1ul

CutSmart buffer 5ul

pT-ompA-L質(zhì)粒 15ul

ddH2O 28ul

50ul

雙酶切體系： XhoI 1ul

MscI 1ul

CutSmart buffer 5ul

pT-Spc質(zhì)粒 15ul

ddH2O 28ul

50ul

雙酶切體系： XhoI 1ul

SphI 1ul

CutSmart buffer 5ul

pT-ompA-R質(zhì)粒 15ul

ddH2O 28ul

50ul

將pT-ompA-L、pT-ompA-R、pT-Spc的雙酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，對其中ompA-L約882bp、ompA-R約795bp和Spc約1119bp條帶進(jìn)行凝膠回收，將上述三種膠回收產(chǎn)物4℃連接過夜，15ul反應(yīng)體系如下：

10×buffer 1.5ul

ompA-L 4ul

Spc 4.5ul

ompA-R 4ul

T4 DNA ligase酶 1ul

15ul

以上述連接產(chǎn)物作為模板，用ompA-R R和ompA-L F作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收目的片段大小約2800bp的DNA片段，目的片段連接pGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，命名為pT-ompA-LSR并測序；

（4）、自殺性重組質(zhì)粒pDS-ompA-LSR的構(gòu)建：

pT-ompA-LSR質(zhì)粒通過小提試劑盒制備，pDS132質(zhì)粒通過小提中量試劑盒制備，用SphI和BamHI兩個酶對pDS132質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃，酶切2.5h，酶切體系反應(yīng)如下：

雙酶切體系： BamHI 1ul

SphI 1ul

CutSmart buffer 5ul

pDS132 15ul

ddH2O 28ul

50ul

對pT-ompA-LSR用ScaI單酶切，37℃，酶切2.5h，后加NaCN 4ul，100ul無水乙醇，放-80℃低溫冰箱過夜，第二天取出12000r/min離心10min，去上清，后在用75%的乙醇，重懸，12000r/min離心10min，去上清重復(fù)兩次，將離心管風(fēng)干后用SphI和BamHI雙酶切，37℃，酶切2.5h，分部酶切體系反應(yīng)如下：

單酶切體系： ScaI 1ul

CutSmart buffer 5ul

pT-ompA-LSR 15ul

ddH2O 29ul

50ul

再雙酶切體系： BamHI 1ul

SphI 1ul

CutSmart buffer 5ul

ddH2O 43ul

50ul

將pDS132雙酶切產(chǎn)物6000bp條帶回收，pT-ompA-LSR三酶切產(chǎn)物2800bp條帶回收，將兩種膠回收產(chǎn)物4℃連接過夜，10ul反應(yīng)體系如下：

10×T4 DNA ligasebuffer 1ul

ompA-LSR DNA片段 4ul

pDS132 載體 4ul

T4 DNA ligase酶 1ul

10ul

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli BW19851感受態(tài)細(xì)胞中，通過含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板篩選重組質(zhì)粒，挑單菌落到LB液體培養(yǎng)基中含有同種抗性，37℃振蕩培養(yǎng)6h，通過酶切鑒定陽性的重組質(zhì)粒；

（5）、將自殺質(zhì)粒pDS-ompA-LSR轉(zhuǎn)到BW19851大腸桿菌中：

將自殺質(zhì)粒pDS-ompA-LSR轉(zhuǎn)化到E.coli BW19851感受態(tài)細(xì)胞中，通過含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板篩選重組質(zhì)粒，挑單菌落到LB液體培養(yǎng)基中含有同種抗性，37℃振蕩培養(yǎng)6h，通過酶切鑒定陽性的重組質(zhì)粒；

（6）、將（5）中含有自殺質(zhì)粒的BW19851大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌CH3用雙親本濾膜結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法結(jié)合，使同源臂導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌CH3的基因組中，通過同源臂交換和壯觀霉素抗性基因篩選得到陽性克隆；

c、取新鮮大腸桿菌 BW19851-pDS132-OmpA-LSR 和鴨疫里默氏桿菌 CH3，分別在含100μg/mL Amp的 LB 固體培養(yǎng)基上和 TSA 固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；

d、用濃度為 10mmol/L 的 MgSO4 溶液 5ml 將兩種細(xì)菌從平板上洗下來，收集1ml菌體到1.5ml 離心管內(nèi)，4℃ 5000rpm，離心 5min，再用 1ml 濃度為 10mmol/L 的 MgSO4 洗2 次，用 1ml 濃度為10mmol/L 的 MgSO4 重懸；

e、按照供體菌 BW19851-pDS132-OmpA-LSR 與受體菌 CH3，按濃度比 1：2 的比例混勻，BW19851-pDS132- TonB1-LSR 菌數(shù)為 2×108CFU，鴨疫里默氏桿菌 CH3 菌數(shù)為 4×108 CFU，用無菌 0.22μm 微孔混合纖維濾膜上過濾；

f、用無菌鑷子夾取濾膜置于 TSA 固體培養(yǎng)基上，30℃ 5% CO2培養(yǎng) 8h；

g、取出濾膜，用 5mL 濃度為 10mmol/L 的 MgSO4 溶液將濾膜上的細(xì)菌洗脫下來，取50-100μL 涂布于含壯觀霉素（80μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL)的 TSA 固體培養(yǎng)基上，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 24h 以上至長出單菌落，

h、挑取單菌落至含壯觀霉素和卡那霉素的 TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

Riemerella anatipestifer CH3株基因缺失株CH3△OmpA的篩選與鑒定：

挑取在Spc和Kan抗性選擇平板上生長的細(xì)菌克隆為候選突變株，做進(jìn)一步的PCR鑒定和Western blot 分析：

PCR鑒定：挑取可能的重組子克隆增殖，用PCR分別擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因Spec、鴨疫里默氏桿菌的16 S rRNA基因和ompA基因ORF，基因型為16 S rRNA+Spec+OmpA-的接合子克隆為OmpA依賴外膜蛋白受體ompA基因的缺失株，命名為CH3△OmpA，

Western blot 分析：將 CH3 野生株，轉(zhuǎn)接于 TSB 培養(yǎng)基，CH3△OmpA株，轉(zhuǎn)接于卡那霉素50ug/mL和壯觀霉素80ug/mL的TSB培養(yǎng)基； cCH3△OmpA株轉(zhuǎn)接于，卡那霉素50ug/mL，壯觀霉素80ug/mL和頭孢西丁1ug/mL的TSB培養(yǎng)基中， 37℃過夜培養(yǎng)，12000rpm 離心5min，棄上清，沉淀用 PBS 洗 3 次，最后用適量 PBS 懸浮后與等量 2×buffer 混合后煮沸 10min，以 5ug 的蛋白量作 SDS-PAGE 電泳，將電泳后的凝膠取出，電轉(zhuǎn)印 1h，轉(zhuǎn)印好的纖維素膜置于 PBST中漂洗 3 次，每次 3-5 min，將膜置于含 10%脫脂乳的 PBST 中 4℃封閉過夜，PBST漂洗 3 次， 每次 15 min，加入 1：200 稀釋的 1 型 WJ4 OmpA 陽性血清，作用1h，再以 PBST 漂洗 3 次,每次15min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠二抗進(jìn)行稀釋，作用1h，以 PBST 漂洗 3 次,每次15min后用ECL 顯色，即可。