[發明專利]一種NK細胞培養試劑盒及其使用方法和得到的NK細胞

在審

• 申請號: 201710145846.8
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN107058222A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 熊亮;魯振宇;張冰晶;韓洪起;秦臻;高婧彧;徐悅;黃文敬
• 申請（專利權）人: 天津普瑞賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明涉及細胞生物技術領域，尤其是一套可標準化生產操作的NK細胞培養試劑盒及其使用方法和得到的NK細胞。使用該試劑盒和基本實驗耗材可短時間內便捷的擴增大量NK細胞,為體外大規模擴增NK細胞和相關研究及臨床試驗提供便利。

背景技術

2000年國際腫瘤生物治療及基因治療年會中指出“免疫細胞療法是現代科技中唯一有可能徹底清除癌癥細胞的方法”。夢想照進現實，癌癥正在逐漸被人類戰勝。細胞免疫療法是除手術、放療、化療以外的第四大癌癥治療模式。NK細胞作為免疫治療臨床研究中的熱點，其誘導和擴增的方法各不相同，且誘導出的細胞數量和質量也參差不齊。沒有一套簡單、高效、穩定的誘導試劑盒。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一套簡便安全的NK細胞培養試劑盒及其使用方法和得到的NK細胞。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種NK細胞培養試劑盒,試劑盒包含NK試劑套盒和NK耗材套盒：

NK試劑套盒包括：一支10ul預處理因子NK-A、一支40ul預處理因子NK-B、一支40ul擴增因子NK-C、一支500ul擴增因子NK-D、一支500ul擴增因子NK-E和一瓶1000ml無血清淋巴細胞培養基，按質量濃度，各因子的成分如下，溶劑為無血清淋巴細胞培養基；

預處理因子NK-A：

CD16mAb2-5mg/ml

Retronectin5-10mg/ml

預處理因子NK-B：

CD16mAb2-5mg/ml

擴增因子NK-C：

15000IU/ug IL-235-60ug/ml

7000IU/ug IL-1250-100ug/ml

7000IU/ug IL-1525-50ug/ml

擴增因子NK-D：

15000IU/ug IL-235ug-60ug/ml

7000IU/ug IL-1525ug-50ug/ml

擴增因子NK-E：

15000IU/ug IL-235ug-60ug/ml

7000IU/ug IL-1225-50ug/ml

7000IU/ug IL-1525-50ug/ml

NK耗材套盒包括：兩支單核淋巴細胞分離離心管、一個細胞加樣預灌支架、一個細胞培養袋和一個細胞培養袋托盤。

所述單核淋巴細胞分離離心管由聚丙烯離心管和水平固定在聚丙烯離心管中的多孔異形篩板組成，靠近管壁處的多孔異形篩板上有方便加入淋巴細胞分離液的缺口，篩板檔網的孔徑為20-40μm。

所述聚丙烯離心管為50ml，多孔異形篩板固定于15ml刻度處。

所述細胞加樣預灌支架由托板和支架組成，支架包括第一支架板和第二支架板，托板與第一支架板之間、第一支架板和第二支架板之間均采用旋轉卡扣式結構連接，第一支架板旋轉270°后固定，第二支架板旋轉90°固定，使第一支架板垂直于托板上，第二支架板平行托板并相距一定距離，第二支架板為雙層隔板，與旋轉卡扣相對的一側帶有開口的“U”槽，兩層隔板之間預留5mm距離，使注射器空桶托耳能水平推入兩層隔板之間。

所述細胞培養袋托盤為四方形，細胞培養袋托盤底部設置有方便氣體交換的多個透氣孔，細胞培養袋托盤上面四角設置有使多個細胞培養袋托盤重疊放置的水平托耳。

上述NK細胞培養試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)取T-75細胞培養瓶，加入5ml無血清淋巴細胞培養基、一支預處理因子NK-A，包被培養瓶，CO₂培養箱孵育2小時或4℃過夜；

(2)取兩支單核淋巴細胞分離離心管,在每支單核淋巴細胞分離離心管中沿預留加樣口加入15ml淋巴細胞分離液，在每支離心管中從篩板擋網處加入采集常規外周血或臍帶血30ml，Ficoll-Hypaque密度梯度離心，2000rpm/min，離心23min；

(3)收集步驟(2)中上層血漿，將收集的血漿置于56℃水浴鍋30min以滅活補體；3000rpm/min，離心6min除去血漿中析出物,并將上層自體血清轉移至離心管，放置于4℃冰箱備用；

(4)收集步驟(2)中的白膜層細胞，洗兩次，獲得全部的單核細胞；

(5)取步驟(1)中包被的培養瓶,用30ml無血清淋巴細胞培養基重懸細胞并接種細胞，補加一支擴增因子NK-C和步驟(3)中備用的自體血清2ml，將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養；