[發(fā)明專利]柏樹微衛(wèi)星分子標(biāo)記組合、引物篩選方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710144855.5
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN107190053B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃麗莎;張玉平;曹均;毛建豐;劉國彬
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué);北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京市廣友專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 11237
• 代理人: 張仲波

本發(fā)明公開了一組多態(tài)性柏樹葉綠體微衛(wèi)星分子標(biāo)記組合，其引物組合及篩選方法、和應(yīng)用，屬林業(yè)分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。應(yīng)用中，鑒定柏樹葉綠體微衛(wèi)星分子標(biāo)記引物多態(tài)性的方法包括：對設(shè)計的引物對正向引物的5’端加上M13尾巴序列與特異反向引物及帶有熒光標(biāo)記的通用型M13引物和基因組DNA混合并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳分離測序得到柏樹葉綠體微衛(wèi)星分子標(biāo)記的多態(tài)性引物；鑒定柏樹親緣關(guān)系的方法包括：提取柏樹的基因組DNA；采用柏樹葉綠體微衛(wèi)星分子標(biāo)記的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳分離，毛細(xì)管電泳測序，統(tǒng)計STR多態(tài)性，多態(tài)性引物能夠反映柏樹細(xì)胞質(zhì)基因組的遺傳信息，可用于柏樹的種質(zhì)資源分類、遺傳多樣性分析等研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及林業(yè)分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及柏樹分子標(biāo)記技術(shù)，更具體涉及一種柏樹微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其篩選方法和在鑒定柏樹親源關(guān)系及品種鑒定和輔助育種中等領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

柏科植物很多種類是主要的木材原料，并且被廣泛地應(yīng)用于園藝、醫(yī)藥等領(lǐng)域。柏樹全身是寶，樹脂、樹油、果實(shí)、枝節(jié)、樹葉均能入藥使用。而以側(cè)柏的種子柏子仁和側(cè)柏葉在臨床上應(yīng)用得最為廣泛。種仁：甘，平，可養(yǎng)心安神，止汗，潤腸。枝梢及葉：苦澀，微寒涼血止血，生發(fā)烏發(fā)，可治吐血、痢疾、痔瘡、燙傷等癥。中國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，柏樹發(fā)出的芳香氣體具有清熱解毒、燥濕殺蟲的作用，可祛病抗邪，培養(yǎng)人體正氣。據(jù)測試，其主要成分為菘萜、檸檬萜。這些天然物質(zhì)不僅能殺滅細(xì)菌、病毒，凈化空氣，而且具有松弛精神、穩(wěn)定情緒的作用。人們吸入柏樹的香味后，可使血壓下降，大腦血流量減少，抑郁情緒得到緩解。柏樹的根、桿、疙頭都含有揮發(fā)油，名日柏木油(Cedarwood oil)或柏香油。柏木原油經(jīng)減壓蒸餾而得柏木精油，出口一般叫B、P、C柏木精油，它的主要成分是柏木醇(柏木腦)、柏木烯和少量的萜烯類化合物。柏木精油廣泛應(yīng)用于香料、醫(yī)藥和國防工業(yè)的原料。

柏科種植資源豐富，是分布最廣的針葉植物，除了南極洲以外世界各地都有它的分布，包括27個屬(其中有17個單型屬)大約有142個種。長期的自然進(jìn)化和選擇過程，產(chǎn)生了豐富的遺傳變異資源，又稱種植資源。種質(zhì)資源的準(zhǔn)確區(qū)分與鑒定是進(jìn)行良種選育和遺傳改良的基礎(chǔ)。但是關(guān)于柏科資源分布、種群遺傳多樣性和種質(zhì)資源保護(hù)等方面的研究尚未見報道，對于柏科植物的種質(zhì)資源鑒定、分子輔助選育等方面研究尚屬空白。微衛(wèi)星有助于鑒定柏樹品系，并區(qū)分出偽品。同時，利用微衛(wèi)星標(biāo)記對柏樹分子育種的研究尚且很少，其中一個重要的限制因素就是分子標(biāo)記技術(shù)的缺乏，尤其是柏科的基因組巨大而復(fù)雜，低成本、高通量的分子標(biāo)記技術(shù)的建立對于柏科遺傳鑒定、分子輔助選育有重要價值。

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱作短串連重復(fù)(Short Tandem Repeats，STRs)、簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)。是指一類遍布于生物基因組中的由幾個核苷酸對(稱為核心序列，一般為1～6bps)為重復(fù)單位組成的簡單串聯(lián)重復(fù)。其重復(fù)次數(shù)在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復(fù)的兩端卻是相對保守的單拷貝序列，與其它標(biāo)記技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn)：首先，在每個微衛(wèi)星DNA兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，尤其在親緣關(guān)系相近的物種間是保守的，而且在一些緊密相關(guān)的物種中其重復(fù)單位和重復(fù)次數(shù)具有一定的相似性。其次，這些小的、串聯(lián)排列的重復(fù)序列經(jīng)常是通過核苷酸鏈的滑動錯配或者其它未知的過程來改變它們的長度，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星在數(shù)量上的差異。微衛(wèi)星的突變率高：每代每個配子的每個位點(diǎn)有25每個配子的～15每個配子突變，因此造成了它們的多態(tài)性。微衛(wèi)星寡聚核苷酸的重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同基因型間差異很大。微衛(wèi)星通常是復(fù)等位的，代表每個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目高度可變。微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性比RFLP顯著增高據(jù)此設(shè)計引物，即可通過PCR技術(shù)分析核心序列重復(fù)次數(shù)的變異，在不同的遺傳型間檢測到多態(tài)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型：單一型(pure)，復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)