[發明專利]一種病原性魚腸道弧菌快速檢測試紙

有效

• 申請號: 201710144785.3
• 申請日: 2017-03-11
• 公開（公告）號: CN106802350B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 繩秀珍;李嘉文;戰文斌;唐小千;邢婧
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的檢測試紙包括載體板、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；其中樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜位于載體板的中部；樣品墊與硝酸纖維素膜交界處設有載有金標兔抗魚腸道弧菌抗體的金標墊，金標墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜之上；其特征在于，所述的硝酸纖維素膜上從靠近金標墊一側開始設有依次排列的四條檢測線T1、T2、T3、T4和一條質控線C；其中檢測線T1為魚腸道弧菌的外膜蛋白、檢測線T2為鞭毛蛋白、檢測線T3為魚腸道弧菌的胞外產物、檢測線T4為全菌破碎蛋白；質控線C包被有羊抗兔IgG；

所述的檢測線T1、T2、T3、T4上抗原蛋白的劃線濃度分別為外膜蛋白0.3mg/mL、鞭毛蛋白0.5mg/mL、胞外產物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

2.如權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的兔抗魚腸道弧菌抗體的制備方法如下：

將魚腸道弧菌擴大培養，并將菌液濃度調至1×10⁸CFU/mL，福爾馬林滅活后免疫純種新西蘭大白兔；第一次混入弗氏完全佐劑，間隔一周后加強免疫，混入弗氏不完全佐劑，間隔兩周后重復一次；一周后取血，分離得到血清，純化得到兔抗魚腸道弧菌抗體。

3.如權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的魚腸道弧菌外膜蛋白，其制備方法如下：

將魚腸道弧菌擴大培養，離心后磷酸鹽緩沖液洗滌，重懸至原體積1/25，加入10％蔗糖，混勻后-20℃下作用15min；室溫下加入等體積0.4％Triton-X100，作用一段時間后離心取上清，加入2.5倍體積的冰乙醇-20℃過夜；離心取沉淀，洗滌重懸后，加入等體積KI溶液，37℃作用1h；離心取上清，加入2.5倍體積冰乙醇-20℃過夜；離心取沉淀，重懸后透析、凍干得到魚腸道弧菌外膜蛋白。

4.如權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的魚腸道弧菌鞭毛蛋白，其制備方法如下：

將魚腸道弧菌擴大培養，離心后PBS洗滌、重懸至原體積1/20，用1mol/L HCl調整pH＝2.0，攪拌30min后低溫離心取上清；上清液調整pH至中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置過夜；低溫超高速離心，取沉淀，重懸后透析、凍干得到魚腸道弧菌鞭毛蛋白。

5.如權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的魚腸道弧菌胞外產物，其制備方法如下：將魚腸道弧菌接種于液體培養基中培養后，將液體培養物涂布于預先放置了一層玻璃紙的固體瓊脂平板上，37℃培養36h；用PBS洗下菌體，收集菌體后4℃下高速離心；將上清經微孔濾膜過濾，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置過夜；然后低溫離心取沉淀，重懸后透析、凍干得到魚腸道弧菌胞外產物。

6.如權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙，所述的魚腸道弧菌全菌破碎蛋白，其制備方法如下：

將魚腸道弧菌擴大培養，菌液置于超聲波破碎儀中低溫破碎得到全菌破碎液，凍干得到魚腸道弧菌全菌破碎蛋白。

7.權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙在非疾病診斷治療目的檢測魚腸道弧菌中的應用。

8.一種非疾病診斷治療目的檢測魚腸道弧菌的方法，其特征在于，所述的方法是使用權利要求1所述的魚腸道弧菌快檢測試紙來檢測待測樣品，所述的方法的判定標準如下：

如果質控線C線呈現紅色條帶，而檢測線T1、T2、T3、T4線皆不顯色，結果為魚腸道弧菌陽性；

如果質控線C線及檢測線T1、T2、T3、T4線皆出現紅色條帶，結果為魚腸道弧菌陰性；

如果質控線C線及檢測線T4檢測線顯色，而檢測線T1、T2、T3線出現1條或多條線不顯色，則檢測結果為魚腸道弧菌陰性，但有其他菌的交叉反應。