[發(fā)明專利]一種用于角膜疾病治療的上皮細(xì)胞片的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710144019.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN108567995A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛琦;石躍由佳;吳復(fù)躍;何振東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海睿泰生物科技股份有限公司;合肥欣睿生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61L27/38
• 分類號(hào): A61L27/38;A61L27/50;C12N5/071
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 張靜

本發(fā)明涉及組織工程口腔黏膜上皮細(xì)胞片的制備方法。具體地，本發(fā)明提供一種口腔黏膜上皮細(xì)胞片的制備方法，包括以下步驟：(a)口腔黏膜組織采集步驟；(b)口腔黏膜上皮細(xì)胞提取步驟；(c)口腔黏膜成纖維細(xì)胞提取步驟；(d)上皮細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)支架制備步驟；(e)口腔黏膜上皮細(xì)胞與口腔黏膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)步驟；以及(f)制備得到的上皮細(xì)胞片與同培養(yǎng)材料的分離步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程與生物制品領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于角膜疾病(尤其是角膜眼表疾病)治療的上皮細(xì)胞片的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人的眼角膜共分5層，由前向后依次為：上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層。上皮細(xì)胞層是最外面的一層，厚度約為50微米，占整個(gè)角膜厚度的10％，由5-6層細(xì)胞所組成。角膜周邊部上皮增厚，細(xì)胞層數(shù)增加到8-10層。角膜上皮共有3種類型的細(xì)胞：基底細(xì)胞、翼狀細(xì)胞、扁平細(xì)胞。上皮細(xì)胞間以橋小體相接，構(gòu)成致密的質(zhì)膜，這層致密堅(jiān)固的屏障可阻止大部分微生物的侵入，阻止淚液中液體和電解質(zhì)進(jìn)入基質(zhì)層，使得角膜處于相對(duì)脫水狀態(tài)。由于外界原因和/或自身原因角膜上皮層會(huì)發(fā)生各種損傷和/或病變，情況嚴(yán)重導(dǎo)致失明。

化學(xué)傷、熱灼傷或其他疾病(例如，Steven-Johnson、眼天皰瘡等)可導(dǎo)致眼表?yè)p傷，破壞角膜上皮的結(jié)構(gòu)和功能。目前，目前臨床治療主要依賴于異體角膜移植，但供體材料來(lái)源有限等困難嚴(yán)重制約了這一治療方法的應(yīng)用。而且，異體角膜移植仍然存在術(shù)后免疫反應(yīng)，甚至出現(xiàn)供體排斥而致手術(shù)失敗。

此外，現(xiàn)有治療方法還包括人工角膜移植。目前，已有多種人工角膜應(yīng)用于臨床，但其材料均達(dá)不到理想要求。而且，由于人工角膜的晚期并發(fā)癥：角膜溶解、植入物排出、房水滲漏、眼內(nèi)炎、人工角膜后增生膜、青光眼等，目前僅適用于常規(guī)角膜移植失敗的雙眼角膜混濁性失明患者，一般只作為最后的選擇。

還可采用的另一種治療方法是：羊膜移植。人羊膜可作為基底膜、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和分化以及抗炎癥抗粘連等用于眼表疾病的治療，但羊膜是來(lái)源于異體組織，難免會(huì)帶來(lái)供體的相關(guān)物質(zhì)，其安全性值得考慮。

最近新起的一種治療方法是：生物角膜移植，生物角膜雖然可以解決供體緊張及人工角膜缺陷的一些問(wèn)題，但其來(lái)源是異種屬，難以避免排異反應(yīng)，其安全性值得考慮。

隨著組織特異性干細(xì)胞知識(shí)的不斷深入以及組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，自體角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)形成細(xì)胞片，用于眼表?yè)p傷的重建取得令人滿意的臨床效果。但是對(duì)于雙眼眼表?yè)p傷的患者，因沒(méi)有健康的角膜緣組織可供取材，故無(wú)法開展。

因此，本領(lǐng)域迫切需要一種更佳的角膜損傷治療方法，既能解決供體不足的問(wèn)題，同時(shí)也能避免異體移植可能發(fā)生的排斥反應(yīng)以及長(zhǎng)時(shí)間使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑帶來(lái)的一系列不良反應(yīng)，從而為L(zhǎng)SCD患者提供了個(gè)體化可行性治療方案。

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明的一方面，提供了一種口腔黏膜上皮細(xì)胞片的制備方法，包括以下步驟：

(a)口腔黏膜組織采集步驟；

(b)口腔黏膜上皮細(xì)胞提取步驟；

(c)口腔黏膜成纖維細(xì)胞提取步驟；

(d)上皮細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)支架制備步驟；

(e)口腔黏膜上皮細(xì)胞與口腔黏膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)步驟；以及

(f)制備得到的上皮細(xì)胞片與同培養(yǎng)材料的分離步驟。

在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(b)中口腔黏膜上皮細(xì)胞采用Ⅰ型中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶進(jìn)行消化。

在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(c)中口腔黏膜成纖維細(xì)胞采用經(jīng)Ⅰ型中性蛋白酶消化后的結(jié)締組織塊貼附培養(yǎng)法培養(yǎng)提取。