[發(fā)明專利]一種與肺腺癌早期診斷相關(guān)的血清外泌體中的miRNA標志物及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710142237.7
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106755544A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉晶;孫瑜;王亮;馮敏;李琳;馬靜云
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司21212
• 代理人: 劉慧娟,李馨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和診斷學領(lǐng)域，具體涉及一種用于肺腺癌早期診斷的血清外泌體miRNA標志物及應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺癌診斷缺乏早期診斷方法和特異性生物標志物

肺癌是全球范圍內(nèi)第二大高發(fā)癌癥(男性發(fā)病率最高為前列腺癌；女性發(fā)病率最高為乳腺癌)。全球每年死于肺癌的人數(shù)超過120萬人次，約占全球死亡人數(shù)的28％。雖然目前一些應(yīng)用于肺癌診治的分子靶向療法頗有成效，然而病人的五年生存率仍不容樂觀。原因在于缺乏早期的診斷方法和診斷分子標志物，大部分肺癌患者確診時已處于疾病晚期。

目前肺癌的診斷主要依賴于胸部X線檢查、胸部CT、磁共振顯像(MRI)等影像學診斷、病理組織學診斷和血清學腫瘤標志物的化學診斷。臨床上應(yīng)用于肺癌診斷的血清分子標志物為癌胚抗原(CEA)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，鱗狀細胞癌抗原(SCC)，糖鏈抗原125(CA125)，角蛋白19片段(CYFRA21-1)，組織多肽抗原(TPA)等。而這些血清學標志物為廣譜的癌癥診斷分子標志物，對于肺癌的特異性診斷和早期診斷所發(fā)揮的作用具有很大的局限性。因此，開發(fā)肺癌特異性的血清學分子標志物對于肺癌的早期診斷無疑具有重要的臨床意義。

外泌體是體液活檢的重要組成部分；能反映其所來源組織的動態(tài)信息

體液活檢目前常用檢測的對象有循環(huán)腫瘤細胞、cell-free DNA、循環(huán)RNA和外泌體等。外泌體是細胞經(jīng)過"內(nèi)吞-融合-外排"而形成的細胞外納米級小囊泡，直徑為30-100nm。正常細胞和癌細胞在生理和病理條件下均能夠釋放外泌體。外泌體不僅存在于細胞培養(yǎng)基中，在體液中也廣泛存在。常用的外泌體提取方法為蔗糖密度梯度離心(1.13–1.19g/mL)或超速離心法(100，000g for 70min)。外泌體為脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，其膜表面高表達四跨膜蛋白超家族如CD63，CD81，CD9，熱休克蛋白(HSP)和MHCI，而這些蛋白也成為外泌體鑒定的表面標記物。外泌體在血液、尿液、腹水甚至羊水等體液中廣泛存在，并且可以通過體液運輸。外泌體的內(nèi)容物包含很多遺傳信息(蛋白、mRNA和miRNA)，這些遺傳物質(zhì)能夠反映其所在周圍環(huán)境和其所來源組織的動態(tài)信息。

開發(fā)肺癌外周血液樣本中microRNA作為生物標志物的必要性

所謂疾病的生物標志物，是指在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，由于機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變、生理代謝過程異常等而引起的異?；纳镏笜?。通過檢測某種疾病特定的生物標志物，對于疾病的診斷、治療和療效評價、預(yù)防乃至預(yù)后評估都具有重要的指導(dǎo)性作用。外周血液樣本在眾多的體液樣本中是臨床檢驗上必不可少的常規(guī)檢測項目，因此開發(fā)外周血液樣本來源的生物標志物，必然具有重要的臨床疾病輔助診斷作用。

由于臨床上目前輔助肺癌診斷的血清分子標志物為腫瘤學常用的廣譜標志物，因此臨床研究者們正致力于開發(fā)肺癌血清中的肺癌生物標志物以提高診治的準確性。miRNA作為一種21-23nt的小分子RNA，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。差異表達的miRNA可能作為疾病早期診斷、分子分型和預(yù)后診斷的指標。

體液來源外泌體miRNA與體液中游離miRNA相比在臨床診斷應(yīng)用方面的優(yōu)勢

(1)外泌體中分子內(nèi)容物含量豐富：目前在外泌體中共發(fā)現(xiàn)9769種蛋白質(zhì)、3408種mRNAs、2838種micro RNAs和1116種脂質(zhì)分子。因此，篩選肺癌外周血液樣本來源的外泌體中的差異表達的miRNA，可能作為診斷、預(yù)測和治療的生物標志物。

(2)穩(wěn)定性強：外泌體直徑僅30～100nm，可以避免被巨噬細胞吞噬。另外，外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)所包含的生物分子，使其不被體液中的酶類降解。因此，與cell-free DNA、循環(huán)RNA等游離生物分子相比，檢測外泌體內(nèi)容物中與疾病相關(guān)的生物標志物，可以得到更為穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。

(3)特異性強：外泌體miRNA不是隨機整合入外泌體中的，而是通過一種選擇機制進入外泌體，因此外泌體中的miRNA更具特異性。

(4)檢測流程易標準化：外泌體miRNA因其穩(wěn)定性好、含量較為豐富等特點，使其試驗方法更容易標準化，所以，研究外泌體miRNA相比于直接分析血液中游離miRNA具有明顯的優(yōu)勢。

因此，外泌體可以作為臨床體液樣本的重要檢測項目，其存在的廣泛性、良好的生物穩(wěn)定性、樣本來源的簡易而又非侵入性使其在臨床樣本檢驗、診斷方面具有不容忽視的應(yīng)用前景。開發(fā)血清外泌體中與肺癌早期診斷相關(guān)的血清外泌體中miRNA標志物，必然提高肺癌診斷的準確率和特異性，從而有利于肺癌的早期診斷。