[發明專利]一種高含量蝦青素血球藻的規模化生產方法

在審

• 申請號: 201710141504.9
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106906142A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 朱展;董浩;曹喜梅;楊蘭蘋;高嵩
• 申請（專利權）人: 煙臺布魯拜爾生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N15/01;C12P23/00;C12R1/89
• 代理公司: 煙臺智宇知識產權事務所(特殊普通合伙)37230
• 代理人: 李增發

1.一種高含量蝦青素血球藻的規模化生產方法，其特征在于：包括藻種的培養、種瓶培養、封閉式管道光生物反應器培養、室內池光生物反應器培養和室外池反應器蝦青素累積培養；藻種先在實驗室內優化的生長條件下，使其快速生長繁殖，待累積到一定的細胞量后，通過無菌管路接種到封閉式管道光生物反應器中進行二級擴大培養，待紅球藻生長到一定密度，再接種到室內池式光生物反應器中進行三級生長培養，達到最高藻細胞數，隨后將培養完成后的紅球藻綠色細胞轉入室外池式生物反應器中，在脅迫條件下使其大量累積蝦青素，最終完成雨生紅球藻的規模化生產流程。

2.根據權利要求1所述的一種高含量蝦青素血球藻培養方法，其特征在于：所述的種瓶培養階段是采取誘變育種的方法篩選出室內外生長均適合，且生長周期短，生產率高，蝦青素含量高的藻株，包括如下步驟：

1）EMS誘變：將Haematococcus pluvialis 系列雨生紅球藻天然藻種培養到對數生長期的藻液600ml，4000rpm離心5min，棄上清液；將不同劑量EMS加入到0.06M、pH值為7. 0的磷酸緩沖液中配置得到最終濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的誘變液，分別將藻體加入六種誘變液中在黑暗條件下處理4h，然后加入1ml、5%的硫代硫酸鈉終止誘變反應，離心去除誘變液，藻體用新鮮營養液洗滌兩次，避光12h后置于光照條件下培養；

2）疊氮鈉誘變：將Haematococcus pluvialis 系列雨生紅球藻天然藻種培養到對數生長期的藻液900ml均分到9個250ml的三角瓶中，取不同量的疊氮鈉溶液加入各個三角瓶中，迅速混勻，使疊氮鈉的最終的濃度分別為100 mg/L、120mg/L、140mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L，黑暗中處理12小時，4000rpm離心5min，去除誘變液并用新鮮的營養液洗滌兩次，最后將處理后的藻體懸浮到100ml新鮮營養液中，于室溫自然光下培養；

3）突變株的篩選：在超凈工作臺中，將步驟1）和2）處理后的樣品分別在固體瓊脂平板上劃線，之后平板先在光強光照為50~100UM條件下培養，長出綠色藻落后置于200 UM光強條件下誘導蝦青素積累，然后挑取藻落大顏色最紅的單藻落，分離得到了30個雨生紅球藻較優誘變株，再分別接入液體培養液；

4）優良藻株的篩選：將步驟3）篩選出的經過步驟1）EMS誘變的較優誘變株按照步驟2）疊氮鈉誘變的方法再次誘變；將步驟3）篩選出的經過步驟2）疊氮鈉誘變的較優誘變株按照步驟1）EMS誘變的方法再次誘變；經瓊脂平板劃線培養再次分離得到30個變異藻株，培養四、五代后詳細測定各自的生長速率和蝦青素含量，從中找出15個生長速率和蝦青素含量排名靠前的藻株；之后連續培養半年，經20多代后，對于各項特征穩定的藻株，再次測其生長和蝦青素積累情況，從中找到3個可以用于生產試驗的優良藻株；

5）最優藻株的篩選：以BBM培養基作為基礎培養基，接種處在對數生長期的優良變異株于三角瓶內，再放入光照培養箱內培養，以濃度為1.25g/L的NaNO₃為氮源，53.3mg/L-80.0mg/L的中高磷濃度； 1g/L以下較低濃度的碳酸氫鈉為碳源， 0.25~0.5%的鹽度，VB_l2濃度為50~75μg/L，pH值為7.0~8.0，培養溫度24士0.5℃，由40W日光燈提供照明，光照強度為90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期為12∶12，培養時間10~12d，每天定時搖瓶三次，防止細胞貼壁，從中選出最優藻株。

3.根據權利要求1所述的一種高含量蝦青素血球藻培養方法，其特征在于：當所述的封閉式管道光生物反應器為柱式光生物反應器時，其聚乙烯透明塑料袋的底部逐漸窄縮成漏斗狀，保證其底部四周藻液充分流動，營養分布均勻一致，氧氣解析和二氧化碳交換補償充分，采用環形牽引支架增強其抗倒伏性。