[發(fā)明專利]一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體及其表達(dá)方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710141426.2
• 申請(qǐng)日: 2017-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN106834328B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅義勇;宋曉東;柳陳堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N9/88;C12P17/04
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發(fā)明公開了一種S?核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體及表達(dá)方法和應(yīng)用，所述基因重組表達(dá)載體通過(guò)以下方法得到：限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ分別對(duì)pET28?a載體和PCR擴(kuò)增出的LuxS基因純化產(chǎn)物進(jìn)行同步酶切，分別獲得帶有Hind Ⅲ和Xho Ⅰ粘性末端的luxS基因片段和pET28?a載體大片段，采用瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收后，luxS基因片段和載體片段進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，大腸桿菌BL21中含有基因重組表達(dá)載體pET28a?luxS。本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)在細(xì)菌交流介導(dǎo)的有益性狀開發(fā)和有害性狀控制的研究及應(yīng)用領(lǐng)域具有巨大潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體及其表達(dá)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)菌能夠分泌自誘導(dǎo)因子感知周圍環(huán)境中細(xì)菌的密度并調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)，參與調(diào)控細(xì)菌的多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如生物發(fā)光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、細(xì)菌毒力因子分泌等、與人類衛(wèi)生保健、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)等都有密切的關(guān)系。根據(jù)細(xì)菌合成的信號(hào)分子和感應(yīng)機(jī)制不同，QS系統(tǒng)主要分為3種：革蘭陰性菌的AHL-LuxI/LuxR系統(tǒng)、革蘭陽(yáng)性菌中寡肽介導(dǎo)的雙組分感應(yīng)系統(tǒng)與呋喃硼酸二脂類化合物(AI-2)介導(dǎo)的AI-2/LuxS種間群體感應(yīng)系統(tǒng)。由于在自然狀態(tài)下微生物多以不同菌種混合存在的方式生存，并在種間存在廣泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)備受重視。研究其誘導(dǎo)的密度感應(yīng)機(jī)制，有助于理解微生物生物學(xué)行為，并為探索治療微生物感染提供新思路。

細(xì)菌通過(guò)種間群體感應(yīng)通用信號(hào)分子AI-2實(shí)現(xiàn)種間信息交流，而S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)是AI-2合成途徑中的關(guān)鍵酶。AI-2合成途徑中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被作為一種甲基供體,產(chǎn)生的毒性中間產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)水解成S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS催化SRH裂解成DPD和高半胱氨酸，DPD自動(dòng)進(jìn)行分子重排生成信號(hào)分子AI-2。

乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其中不僅有寡肽介導(dǎo)的雙組分感應(yīng)系統(tǒng)，而且存在AI-2/LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)。乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素與對(duì)人體消化道粘附的特性有助于抑制或排擠機(jī)會(huì)致病菌，降低人體被致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明乳酸菌的這些益生特性受QS系統(tǒng)調(diào)控。

目前市面缺少商品化的AI-2，但存在SAH。SRH可在酸性高溫條件下水解，生成SRH，再經(jīng)LuxS體外催化合成DPD。對(duì)于研究AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，有在體外高效的表達(dá)LuxS蛋白，繼而體外合成AI-2用于考察不同實(shí)驗(yàn)組別的差異，能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體及其表達(dá)方法和應(yīng)用。本發(fā)明將S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因(luxS)的重組表達(dá)載體pET28a-luxS，將該表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)，完成S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達(dá)，并通過(guò)親和純化得到目的蛋白。

本發(fā)明第一方面，提供一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體，其特征在于，所述基因重組表達(dá)載體通過(guò)以下方法得到：限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對(duì)pET28-a載體和PCR擴(kuò)增出的LuxS基因純化產(chǎn)物進(jìn)行同步酶切，分別獲得帶有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a載體大片段，采用瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收后，luxS基因片段和pET28-a載體大片段進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，大腸桿菌BL21中含有基因重組表達(dá)載體pET28a-luxS。