[發明專利]牛呼吸道合胞體病毒nano?PCR檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201710141334.4
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN107058619A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 郭利;李建友;李家偉;楊艷玲;王超;王建科;程世鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所(普通合伙)22210
• 代理人: 于曉慶

1.牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：MightyAmp酶、2xBuffer Mix緩沖液、金納米顆粒溶膠、無菌雙蒸水、一對特異性引物和一個牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P1和P2：

P1：5'-TATGCTATGTCCCGATTGG-3'，

P2：5'-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3'；

所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有596個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

所述含有596個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒能夠在大腸桿菌DH5α感受態細胞中增殖。

2.根據權利要求1所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述含有596個堿基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

3.根據權利要求1所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為蒸餾水。

4.制備權利要求1至3中任意一項所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)配制nano-PCR反應液

所述反應液包括：MightyAmp酶、2xBuffer Mix緩沖液、金納米顆粒溶膠、無菌雙蒸水和一對特異性引物；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P1和P2：

P1：5'-TATGCTATGTCCCGATTGG-3'，

P2：5'-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3'；

(2)建立牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒

所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有596個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有596個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒能夠在大腸桿菌DH5α感受態細胞中增殖；

(3)陰性對照：所述陰性對照為蒸餾水。

5.根據權利要求4所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒通過以下方法制備：以牛呼吸道合胞體病毒的NP基因為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到長度為596bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至pMD18-T載體，得到牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

6.根據權利要求5所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，以P1和P2為引物進行PCR擴增的反應條件為：98℃2min；98℃10s，60℃2s，68℃1min，35個循環；68℃總延伸10min。

7.根據權利要求4所述的牛呼吸道合胞體病毒nano-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述金納米顆粒溶膠的直徑為20nm，濃度為0.5μg/μL。