[發明專利]牛病毒性腹瀉病毒nano?PCR檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201710141333.X
• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN107058618A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 郭利;程世鵬;楊艷玲;張淑琴
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所(普通合伙)22210
• 代理人: 于曉慶

技術領域

本發明涉及牛病毒性腹瀉病毒的檢測技術領域，具體涉及一種牛病毒性腹瀉病毒nano-PCR檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrheavirus，BVDV)是由BVDV病毒引起的傳染病，是牛急性呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的重要病原體之一，各種年齡的牛都易感染、以幼齡牛易感性最高，傳染來源主要是病畜。我國養牛產業正處于快速發展期，隨之牛系統性疾病與日俱增，對養牛業危害嚴重。牛病毒性腹瀉(BVD)是各牛場首要防制的傳染病之一，嚴重影響牛的生長發育，可以起母牛繁殖障礙，BVD感染亦可使母牛首次發情時間延遲15-42天，受孕率最高下降達70％，流產風險2.2倍以上，小牛死淘率增加3％以上，青年牛死亡率達20％以上，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾臟等都含有病毒，以直接接觸或間接接觸方式傳播。本病呈全球性分布，各養牛業發達國家均有流行。非細胞病變型BVDV病毒感染牛可產生持續性感染(persistent infection，PI)牛，PI牛的存在導致BVD不易管理，BVD易于與其他病毒和細菌發生混合感染，正因如此給養牛業造成綜合危害性更強。PI牛斷奶牛平均體重與正常牛，且存活期不超過兩年另外BVD還會造成免疫抑制，增加了牛感染其他疾病的幾率。因此BVD防制，對養牛業健康發展意義重大。

BVD給養牛業造成綜合危害性強，所以牛群中BVDV抗原的篩查對于牛場健康良性發展尤為重要，高效合理的檢測技術是疫病診斷的關鍵。目前，用于檢測BVDV臨床樣本中病毒的方法主要包括核酸探針雜交技術、PCR技術、ELISA及中和試驗等。但是這些方法普遍存在易交叉感染、易誤診、耗時費力的問題。

發明內容

為了解決BVD感染常存在交叉感染、易誤診、現有檢測方法耗時費力的問題，本發明提供一種牛病毒性腹瀉病毒nano-PCR檢測試劑盒及其制備方法。

本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發明的牛病毒性腹瀉病毒nano-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括：

MightyAmp酶、2xBufferMix緩沖液、金納米顆粒溶膠、無菌雙蒸水、一對特異性引物和一個牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3'，

P2：5'-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3'；

所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有136個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有136個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒能夠在大腸桿菌DH5α感受態細胞中增殖。

作為優選的實施方式，所述含有136個堿基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作為優選的實施方式，該試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為蒸餾水。

本發明還提供了上述牛病毒性腹瀉病毒nano-PCR檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)配制PCR反應液

所述PCR反應液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix緩沖液、金納米顆粒溶膠、無菌雙蒸水和一對特異性引物；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3'，

P2：5'-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3'；

(2)建立牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒

所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有136個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有136個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒能夠在大腸桿菌DH5α感受態細胞中增殖；

(3)陰性對照：所述陰性對照為蒸餾水。

作為優選的實施方式，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒通過以下方法制備：以牛病毒性腹瀉病毒的NP基因為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到長度為136bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至pMD18-T載體，得到牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。