[發(fā)明專利]一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和前導(dǎo)序列及其分泌表達(dá)

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• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN106755000A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋小平
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/81
• 代理公司: 合肥市長遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙)34119
• 代理人: 崇鑫,劉希慧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶前導(dǎo)序列，及其分泌、表達(dá)、應(yīng)用。

背景技術(shù)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase，TG)能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是一種有效的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑。目前該酶應(yīng)用最廣泛的是在肉制品行業(yè)以改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，提高營養(yǎng)價(jià)值。近年來，TG在生物醫(yī)藥、組織工程、定點(diǎn)蛋白交聯(lián)、紡織和皮革處理等多個(gè)領(lǐng)域擁有十分廣闊的應(yīng)用前景。

微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Microbial transglutaminase，MTG)的生產(chǎn)菌株主要是鏈霉菌，如茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)、吸水鏈霉菌(Streptomyces hygwscopicus)。鏈霉菌MTG是一種胞外酶，以無活性的酶原(pro-MTG)形式分泌，pro-MTG的N-端酶原區(qū)需要被菌體內(nèi)生的金屬蛋白酶(TAMEP)及絲氨酸蛋白酶(serine protease)切除后，才能轉(zhuǎn)化成活性MTG。由于原生產(chǎn)菌株分子改造困難、自身分泌大量蛋白酶且產(chǎn)量提高潛力有限，傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)MTG遠(yuǎn)不能滿足市場需求。效價(jià)比較高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶仍然依賴于國外進(jìn)口，但進(jìn)口酶的價(jià)格昂貴，使企業(yè)的生產(chǎn)成本增加。隨著MTG的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，獲得產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、專一性強(qiáng)、酶活力高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制劑是市場所要求的。

使用異源表達(dá)系統(tǒng)已成功實(shí)現(xiàn)了鏈霉菌pro-MTG或MTG的基因的表達(dá)，但是克隆表達(dá)成熟酶基因mtg直接分泌有活性的酶MTG的策略尚未獲得成功。目前，表達(dá)活性MTG的策略主要有兩種，一種是將pro-MTG與SAM-P45蛋白酶在異源宿主中共同分泌表達(dá)，但此種策略由于發(fā)酵液中殘存的蛋白酶活力可能持續(xù)降解活性TG而造成不利影響，以及蛋白酶的后續(xù)去除會提高分離純化的成本，因此，不適合工業(yè)化要求。另一種是Yurimoto等、李鵬飛等采取將微生物來源的酶原pro-MTG的前導(dǎo)序列(pro)和成熟谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(mtg)編碼區(qū)作為兩個(gè)獨(dú)立的元件進(jìn)行共表達(dá)的策略，成功地實(shí)現(xiàn)了直接分泌表達(dá)活性MTG，但是酶活水平仍然較低。而李鵬飛采取不同于Yurimoto的共表達(dá)策略，通過分別構(gòu)建pro和mtg的基因表達(dá)盒，用SolutionⅠ連接酶連接后放在一個(gè)表達(dá)載體上，獲得pro/MTG共表達(dá)載體pAOα-pro-MTG，在酵母中也直接分泌表達(dá)活性MTG，但是表達(dá)量、酶活水平仍然較低。共表達(dá)策略的重要優(yōu)勢就是無需蛋白酶活化就能夠得到活性的MTG，然而，目前關(guān)于mtg及其pro共表達(dá)的報(bào)道很少。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明將從分子水平對源于茂源鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因(mtg)及其前導(dǎo)序列(pro)進(jìn)行改造得到優(yōu)化基因，使優(yōu)化后的mtg及pro降低轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高轉(zhuǎn)錄效率，提升其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)水平。并運(yùn)用pro和mtg作為兩個(gè)獨(dú)立的元件進(jìn)行共表達(dá)的策略構(gòu)建共表達(dá)重組畢赤酵母體系，實(shí)現(xiàn)在酵母中直接分泌表達(dá)活性MTG，并使優(yōu)化外源基因在酵母細(xì)胞中獲得高效穩(wěn)定表達(dá)。

本發(fā)明采用源于茂源鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因(mtg)及其前導(dǎo)序列(pro)作為原始基因和原始前導(dǎo)序列。

本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；而谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原始基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因相對于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原始基因，其GC含量由原來的64.56％減少到39.94％；CAI值由原來的0.54提高到0.97。

本發(fā)明的目的還在于提供一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶前導(dǎo)序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；而谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原始前導(dǎo)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明前導(dǎo)序列相對于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原始前導(dǎo)序列，其GC含量由原來的67.41％減少到43.7％；CAI值由原來的0.46提高到0.97。

同時(shí)本發(fā)明優(yōu)化后的基因和前導(dǎo)序列在宿主細(xì)胞中的分泌表達(dá)量高。

本發(fā)明的目的還在于提供一種包含上述優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明的目的還在于提供一種包含上述優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶前導(dǎo)序列的表達(dá)載體。