[發明專利]一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株及其功能驗證方法

在審

• 申請號: 201710137301.2
• 申請日: 2017-03-09
• 公開（公告）號: CN106893734A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 辛洪波;陳廷濤;王鑫
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/31;C12N1/21;C12P21/02;A61K49/00;C12R1/42
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1.一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株，其特征在于該菌株是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執行PCR擴增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到Abvec載體上，即得到重組質粒Abvec-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質粒Abvec-pBpp，轉入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質粒Abvec-pBpp，將其通過電轉法導入感受態的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，得到重組表達菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株。

2.根據權利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株，其特征在于步驟2)中pBpp蛋白表達基因與Abvec載體的連接是先經Age I和Bsiw I雙酶切，酶切產物純化后采用T4連接酶連接到Abvec載體上。

3.根據權利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株，其特征在于步驟4)所述的電轉法包括以下步驟：取重組質粒Abvec-pBpp與所述處于感受態的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株在電轉杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉4.7ms。

4.根據權利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的pBpp重組蛋白表達菌株，其特征在于步驟4)所述感受態的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養基培養至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養基中，35～39℃振蕩培養10～14h；

C)取步驟B)培養所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養基中，振蕩培養至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。

5.應用權利要求1所述pBpp重組蛋白表達菌株制備pBpp重組蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：取HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株，以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養板中混合，培養4～16h，而后將細胞培養板中的培養基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養基，培養40～56h，而后破碎細胞收集上清。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于HEK293-T細胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株在細胞培養板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。

8.一種權利要求1所述pBpp重組蛋白表達菌株的功能驗證方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取小鼠，連續5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；

2)取pBpp重組蛋白表達菌株，以灌胃的方式對步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥，每次給藥劑量為10⁵～10⁶CFU，每2天給藥1次；每隔7天監測所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。