[發(fā)明專利]雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710134514.X
• 申請(qǐng)日: 2017-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN106822886A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張毓金;謝秉超;嚴(yán)悌昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州博恒生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61K39/235;A61K9/107;A61P31/14;A61P31/20;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 劉曄

1.一種用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)傳代細(xì)胞系LMH細(xì)胞的制備：將LMH細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化分散傳代，加入DMEM培養(yǎng)液在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至形成生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層，再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，用于雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接種；

(2)種毒繁殖：分別將雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒毒種按終體積為1:50～1:500接種到步驟(1)制備的單層細(xì)胞，并在37℃吸附30～60分鐘后吸棄病毒液，加入細(xì)胞維持液于37℃、5％CO₂單獨(dú)培養(yǎng)58±2小時(shí)，直至細(xì)胞病變CPE達(dá)80％以上，分別收獲雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液；

(3)病毒收集、濃縮和純化：分別將收獲的雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液置于-20℃反復(fù)凍融兩次，5000rpm，4℃離心10min后收集上清液，然后分別使用50K中空纖維柱進(jìn)行濃縮，即為雞傳染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液；

(4)將上述兩種病毒的制苗病毒液進(jìn)行滅活后，等體積混合，乳化制成乳劑型滅活疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的DMEM培養(yǎng)液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)雙抗和0.5～2.5％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸，所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(1)中胰酶-EDTA消化液為含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(2)的細(xì)胞維持液為包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)雙抗、1～3％(v/v)脂質(zhì)體復(fù)合物和1～2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述的脂質(zhì)體復(fù)合物為內(nèi)部包含過氧化氫酶的復(fù)合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述的脂質(zhì)體復(fù)合物的制備為：

(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超聲處理5min；

(2)然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液；

(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150～200nm，得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(2)中pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中含0.2～0.6％(m/v)過氧化氫酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(2)的細(xì)胞維持液還包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(4)中兩種病毒的制苗病毒液等體積混合后，使0.1ml水相中雞傳染性法氏囊含量≥10^8.0TCID₅₀，禽腺病毒4型病毒含量≥10^8.2TCID₅₀。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(4)將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗具體為：

(1)油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用；

(2)水相制備：取滅活后的雞傳染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；

(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化劑進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可；

(4)分裝：將制備的疫苗按照每瓶250mL進(jìn)行分裝。