[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)慶大霉素C1a的工藝方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710133480.2
• 申請(qǐng)日: 2017-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN106801076A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程國(guó)政
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南仁華生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/48
• 分類號(hào): C12P19/48;C12N1/20;C12R1/29
• 代理公司: 洛陽公信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)41120
• 代理人: 程茗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)，特別是涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)慶大霉素C1a的工藝方法。

背景技術(shù)

慶大霉素C1a是國(guó)內(nèi)首創(chuàng)、具備獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類半合成新藥衣替米星的母核前體。傳統(tǒng)制備C1a的方法是采用樹脂分離技術(shù)從多組分慶大霉素中提取C1a單組份，由于各組分之間結(jié)構(gòu)類似，物理化學(xué)性質(zhì)相近，且產(chǎn)量相當(dāng)，導(dǎo)致了提取成本居高不下，市場(chǎng)上高純度C1a售價(jià)居高不下。

已有文獻(xiàn)中從科研角度報(bào)道了利用發(fā)酵搖瓶孵育種液然后進(jìn)行慶大霉素C1a發(fā)酵培養(yǎng)，但是尚未真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)在生產(chǎn)過程中如何實(shí)踐應(yīng)用及各參數(shù)指標(biāo)的確定并不十分清晰。目前發(fā)酵慶大霉素C1a的培養(yǎng)基和工藝基本借鑒了慶大霉素發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，但是在工藝生產(chǎn)中存在小單孢菌產(chǎn)素率低、發(fā)酵用料多和周期長(zhǎng)等問題，造成生產(chǎn)成本普遍較高，另外由于慶大霉素C1a菌株本身與慶大霉素生產(chǎn)菌株雖然同屬于小單孢菌屬但是生理代謝特性存在較大差異，而專屬用于慶大霉素C1a生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法并不完善。因此，改進(jìn)慶大霉素C1a的生產(chǎn)方法已勢(shì)在必行。如何通過調(diào)整培養(yǎng)基配方和工藝控制，使得發(fā)酵液組分與效價(jià)均達(dá)到一個(gè)理性的水平，同時(shí)降低慶大霉素C1a發(fā)酵的生產(chǎn)成本，有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述慶大霉素C1a發(fā)酵生產(chǎn)的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵生產(chǎn)慶大霉素C1a的工藝方法，該方法依賴高效、低成本發(fā)酵生產(chǎn)慶大霉素C1a的培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中進(jìn)行工藝控制，提高了發(fā)酵單位和產(chǎn)量，同時(shí)最大限度降低了原輔料成本。

一種發(fā)酵生產(chǎn)慶大霉素C1a的工藝方法，包括孢子培養(yǎng)、種液制備、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵生產(chǎn)和補(bǔ)料控制的步驟，其中：

所述一級(jí)種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為一級(jí)種子培養(yǎng)基，其組分及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下：可溶性淀粉0.8%-2.0%、玉米粉1%-3%、甘氨酸 0.3%-1.2%、谷氨酸0.8%-2.0%、煙酰胺1.5%-3.0%、葡萄糖1.0%-3%、硫酸銨0.05%-0.5%、硝酸鉀0.01%-0.5%、碳酸鈣0.4%-1.0%、氯化鈷0.001%-0.005%、氯化鈣0.01%-0.05%、泡敵0.01%-0.05%和消沫劑0.01-0.05%，其余為水；

所述二級(jí)種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為二級(jí)種子培養(yǎng)基，其組分及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下：可溶性淀粉1%-4%、玉米粉1%-3%、煙酰胺 1.5%-3.0%、酵母粉 1.0%-5.0%、葡萄糖1.0%-3%、硫酸銨0.05%-0.5%、硝酸鉀0.01%-0.5%、碳酸鈣0.4%-1.0%、氯化鈷0.001%-0.005%、氯化鈣0.01%-0.05%、泡敵0.01%-0.05%和消沫劑0.01%-0.05%，其余為水；

所述發(fā)酵生產(chǎn)所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下：可溶性淀粉1%-4%、玉米粉1%-3%、甘氨酸0.3%-1.2%、谷氨酸 0.8%-2.0%、煙酰胺 1.5%-3.0%、酵母粉1.0%-5.0%、葡萄糖1%-3%、硫酸銨0.05%-0.5%、硝酸鉀0.01%-0.5%、碳酸鈣0.4%-1.0%、氯化鈷0.001%-0.005%、氯化鈣0.01%-0.05%、泡敵0.01%-0.05%和消沫劑0.01-0.05%，其余為水；

所述補(bǔ)料控制是在發(fā)酵生產(chǎn)過程中進(jìn)行補(bǔ)糖、補(bǔ)水、補(bǔ)消泡劑、補(bǔ)堿和補(bǔ)氮操作：

補(bǔ)糖控制：全程還原糖濃度控制在1-20g/L，從發(fā)酵開始至60h，當(dāng)還原糖濃度低于5g/L時(shí)開始補(bǔ)糖，補(bǔ)糖量= ；發(fā)酵60h后當(dāng)還原糖濃度低于5g/L時(shí)，補(bǔ)糖量=；放罐前4h停止補(bǔ)糖；

補(bǔ)水控制：發(fā)酵前50h不補(bǔ)水，50h后黏度達(dá)到2000cp時(shí)開始補(bǔ)水，補(bǔ)水按照流加方式補(bǔ)入，黏度低于2000cp時(shí)停止補(bǔ)水；

補(bǔ)消泡劑控制：一次性補(bǔ)入1-5L無菌消泡劑；

補(bǔ)堿控制：當(dāng)pH低于6.5時(shí)開始補(bǔ)堿，采用流加方式維持pH在6.5-7.5之間；

補(bǔ)氮控制：當(dāng)氨態(tài)氮濃度低于1mg/L時(shí)開始補(bǔ)氮，達(dá)到5mg/L停止補(bǔ)氮。

進(jìn)一步的，所述種液制備的過程為：刮取斜面孢子，制備孢子懸浮液；將孢子懸浮液接入無菌小型發(fā)酵罐中，在34-38℃、100-300rpm/min和通氣比為0.5-15VVM的條件下培養(yǎng)24-48h，得種液。

進(jìn)一步的，所述補(bǔ)糖控制中補(bǔ)充的是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖水溶液。

進(jìn)一步的，所述補(bǔ)水控制中補(bǔ)充的是經(jīng)高壓蒸汽滅菌的純化水。

進(jìn)一步的，所述補(bǔ)氮控制中補(bǔ)充的是質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的硫酸銨水溶液。