[發明專利]用于HPV?CTL細胞的體外培養試劑盒

在審

• 申請號: 201710133123.6
• 申請日: 2017-03-08
• 公開（公告）號: CN106929473A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 邢威;李佳
• 申請（專利權）人: 廣州可伴咨詢中心（普通合伙）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 李穎,周秀梅

技術領域

本發明涉及體外培養試劑盒，具體的說是一種用于HPV-CTL(Human papillomavirus-CTL)細胞的體外培養試劑盒。

背景技術

世界范圍內宮頸癌是婦女第二常見癌癥。每年新發病例約50萬，80％發生在發展中國家，死亡率高達50％。我國每年新發病例13.15萬，占世界總發病人數1/3，每年約5萬人死于宮頸癌。WHO于1992年宣布人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是引起宮頸癌的首要原因。人類乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，有高度的特異性，就女性而言，HPV的終身感染率累積可高達60％～70％。1995年，國際癌癥研究署(IARC)專題討論會將HPV感染確定為宮頸癌的主要病因，明確子宮頸癌是一種感染性疾病。HPV感染是宮頸癌的必要因素，反復或持續的HPV感染可能會導致細胞向惡性表型的轉化。HPV16、18亞型對宮頸移行帶具高度的親和力，與宮頸癌的關系最為密切，稱為高危型HPV。高危型HPV感染是引起宮頸癌和宮頸內上皮瘤變(CIN)的主要因素。早期宮頸癌放療或手術的效果好，而晚期則失去手術機會，主要以放療為主。杜絕及根除HPV就可以預防、治愈宮頸癌,因此有必要尋找一些新的治療手段。

以腫瘤的免疫治療為主的腫瘤生物治療是目前臨床治療惡性腫瘤繼手術、放療、化療之后的第4種模式，它既可以獨立地治療腫瘤，又可與手術及放、化療結合，具有療效高、特異性強、副作用小等優點，尤其對于中晚期已經發生轉移的惡性腫瘤而言，它具有獨到的治療作用，近年來越來越受到人們的關注。但臨床資料表明多種腫瘤細胞可以有效逃避機體的免疫作用，因此腫瘤特異性抗原的免疫治療是抗病毒及抗腫瘤的研究熱點。

基于腫瘤特異性抗原的免疫治療可以啟動以腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應為主的抗腫瘤效應，有效打擊腫瘤，防止轉移復發且不傷及無關組織。因其抗腫瘤特異性和免疫記憶性是其它方法所不能比擬的，故在腫瘤綜合治療中顯示出很好的應用前景。隨著對免疫應答機制的深入研究，人們已經意識到啟動免疫應答程序的并不是整個抗原分子，而是與MHC分子結合的氨基酸短肽，即CTL表位，因此尋找特異性腫瘤抗原及其相應的CTL表位成為腫瘤免疫治療的關鍵。

細胞毒T淋巴細胞(CTL)是目前研究較多的免疫活性細胞，用表達于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原的CTL表位肽刺激機體，可以產生抗原特異性的CTL細胞，從而參與腫瘤免疫應答，其機理在于用CTL表位肽刺激機體后，可引起抗原特異性的CTL細胞的克隆增殖，而CD8+的CTL是目前認為抗腫瘤免疫的主要效應細胞，其向胞外釋放穿孔素、細胞溶解素等物質或通過細胞表面的死亡受體(腫瘤壞死因子受體家族的成員，包括FAS)等溶解(即殺滅)靶細胞，同時亦可分泌IFN-γ等細胞因子間接殺傷腫瘤細胞，為殺傷腫瘤創造一個良好的微環境。體內的初始T淋巴細胞，經過腫瘤抗原刺激后可分化為效應性T細胞即CTL細胞，殺傷腫瘤，其中一部分效應T淋巴細胞可分化為效應型記憶T淋巴細胞，這種記憶性T淋巴細胞對腫瘤相關性抗原再次刺激后可表現出強烈有效的免疫應答，從而發揮殺傷功效，這也是臨床應用CTL抗原肽殺傷腫瘤的一個理論基礎。因此應用基于腫瘤抗原的CTL表位肽直接誘導特異性CTL抗腫瘤應答，已經成為一種方便有效的方法。

綜上所述，用基于腫瘤抗原的CTL表位肽直接誘導抗原特異性CTL的方法，是十分有效的。急需尋找HPV相應的CTL表位肽，建立高效的HPV-CTL細胞體外培養方法，同時也更有必要設計與之相符的規范的試劑盒來保證培養方法的及時、準確、順利進行。

發明內容

本發明的目的是提供一種將人的外周血樣品中的單個核細胞誘導為HPV-CTL細胞的體外培養試劑盒，該試劑盒可以用于HPV-CTL細胞體外定向分選、誘導、分化、培養、擴增。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種用于HPV-CTL細胞的體外培養試劑盒，試劑盒內容物中包括：誘導CTL細胞分化的包被瓶；誘導T細胞分化的包被瓶；刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子；和，使T細胞攜帶相關抗原刺激HPV-CTL細胞增殖、成熟的細胞因子。

所述試劑盒內容物包括無血清培養基、細胞分選液和細胞分散劑，其中，細胞分散劑為10％的人血清白蛋白。

所述誘導CTL細胞分化的包被瓶(CTL3)為經HPV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15包被的包被瓶；