[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)埃博霉素B的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710129937.2
• 申請(qǐng)日: 2017-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN106834377B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張貴民;楊家森;沈書慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/18
• 分類號(hào): C12P17/18;C12N1/20;C12R1/01
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本發(fā)明具體公開了一種生產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵方法，屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域。該方法在種子罐培養(yǎng)過程中流加氨水調(diào)節(jié)pH，得到大量種子菌體；在發(fā)酵過程中流加氨水或丙酸來調(diào)控pH，使得埃博霉素B的產(chǎn)量提高，簡(jiǎn)化了調(diào)控流程，降低了生產(chǎn)成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)埃博霉素B的方法。

背景技術(shù)

埃博霉素(epothilones)是1993年在黏細(xì)菌纖維堆囊菌Sorangium cellulosum的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，其結(jié)構(gòu)為大環(huán)內(nèi)酯類化合物。抗腫瘤作用機(jī)理與紫杉醇相似，具有抑制微管解聚的作用，相比之下，埃博霉素的水溶性更好，并且對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞和耐紫杉醇的腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性，也沒有紫杉醇臨床應(yīng)用中的粒細(xì)胞減少癥、外周神經(jīng)病變、脫發(fā)、過敏等嚴(yán)重副作用。因此，開發(fā)埃博霉素類化合物具有臨床價(jià)值和社會(huì)意義。2007年，埃博霉素類B的衍生物伊沙匹隆在美國批準(zhǔn)上市，激發(fā)了人們對(duì)埃博霉素類化合物研究的熱潮，現(xiàn)已有六種埃博霉素類化合物進(jìn)入了臨床研究階段。

目前，埃博霉素全合成步驟大都在20步以上，無法滿足生產(chǎn)規(guī)模；而大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)又存在諸多困難：埃博霉素的產(chǎn)生菌纖維堆囊菌的代時(shí)較長，生長速度非常緩慢，營養(yǎng)攝取率很低，氧的消耗比較少，發(fā)酵周期長，發(fā)酵時(shí)細(xì)胞濃度較低。因此，如何使纖維堆囊菌迅速生長，并提高埃博霉素的產(chǎn)量，減少主要雜質(zhì)的含量，降低生產(chǎn)成本成為目前埃博霉素B研究的一個(gè)重要課題。

現(xiàn)有文獻(xiàn)，有報(bào)道通過優(yōu)化菌株提高埃博霉素B產(chǎn)量的方法，但對(duì)于纖維堆囊菌ATCC25532的發(fā)酵培養(yǎng)方法報(bào)道不多。經(jīng)研究，中國專利CN103937851A、CN103045675A、CN103772407A和CN103788105A發(fā)酵效價(jià)均低于52mg/L。現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵方法仍然無法滿足大生產(chǎn)的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，克服了埃博霉素B現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)的不足，加速了菌體生長，提高了埃博霉素B的產(chǎn)量，減少了主要雜質(zhì)埃博霉素A的含量，利于后期純化，降低了生產(chǎn)成本。

本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)工藝具體包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法。所述的埃博霉素B生產(chǎn)菌為纖維堆囊菌ATCC25532。

埃博霉素B的培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：

1)固體平板培養(yǎng)：菌種涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)6-7天；

2)搖瓶擴(kuò)培：平板接種于搖瓶中，30℃，200rpm培養(yǎng)4-5天；

3)種子罐培養(yǎng)：將搖瓶接種于種子罐中，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為0.5vvm，罐壓為0.04kg/cm2，并流加酸堿調(diào)節(jié)劑使pH維持在7.2，當(dāng)溶氧下降緩慢時(shí)，進(jìn)行移種；

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：利用壓差法將種子液接入到發(fā)酵罐中，接種量為10％的體積比，30℃，200rpm培養(yǎng)，空氣流量為0.5vvm，維持在50％附近；發(fā)酵過程中加入酸堿調(diào)節(jié)劑維持pH值在7.2，在發(fā)酵48小時(shí)加入大孔樹脂XAD-16N，發(fā)酵96小時(shí)開始測(cè)定效價(jià)。

優(yōu)選地，所述步驟3)種子罐酸堿調(diào)節(jié)劑為氨水。

優(yōu)選地，所述步驟4)發(fā)酵罐酸堿調(diào)節(jié)劑為氨水和丙酸。

優(yōu)選地，所述步驟3)種子罐和步驟4)發(fā)酵罐酸堿調(diào)節(jié)劑的配置濃度為20％-30％，121℃滅菌20min使用。

優(yōu)選地，所述步驟4)發(fā)酵罐采用流加方式進(jìn)行pH自動(dòng)控制，前期補(bǔ)入氨水，后期補(bǔ)入丙酸。

優(yōu)選地，所述步驟1)固體平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基成份為，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2。