[發(fā)明專利]引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710129337.6
• 申請(qǐng)日: 2017-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN106834503A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉朝煜;李小花;徐飛岳;李周芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳因合生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司44228
• 代理人: 張小黎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

血漿游離DNA又稱cfDNA(cell free DNA)，是指外周中游離于細(xì)胞外的DNA，cfDNA的來源既包括正常細(xì)胞，也有異常細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具體包括自身正常細(xì)胞代謝的凋亡小體，腫瘤細(xì)胞碎片，外泌體等。

循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA)ctDNA是指從原發(fā)腫瘤甚至是轉(zhuǎn)移形成的新腫瘤細(xì)胞破裂掉落下來到循環(huán)外周血中的DNA。ctDNA在臨床醫(yī)學(xué)中具有重要意義，通過檢測(cè)ctDNA在腫瘤的早期檢測(cè)，腫瘤的靶向治療和后期的疾病監(jiān)控等方面具有重要的臨床價(jià)值。

ctDNA與所有cfDNA一樣是以核小體微單位，以單個(gè)、雙聯(lián)或者三聯(lián)的形式進(jìn)入血液，片段長(zhǎng)度主要在166bp左右(即纏繞在每個(gè)組蛋白上面的DNA的長(zhǎng)度)，并逐步分解，通常半衰期只有2個(gè)小時(shí)。一般10ml外周血中cfDNA含量約在32ng(Newman et al,2016)。

ctDNA含量非常少，以10ml外周血為例，從中可以提取到cfDNA含量約30ng，占總DNA的1％，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％計(jì)算,只有約300pg，也就是大約45個(gè)細(xì)胞裂解的DNA量，實(shí)際情況下，如果是做早期篩查，ctDNA的含量可能更低到10ml外周血中只有1～2個(gè)細(xì)胞的，所以對(duì)檢測(cè)方法的敏感性要求非常高。

目前用于液體活檢中目標(biāo)基因檢測(cè)的方法主要分為四類：一代測(cè)序(Sanger)，二代高通量測(cè)序(NGS)，數(shù)字液滴PCR(ddPCR)，和ARMS(又稱等位基因特異性PCR)。對(duì)于腫瘤基因的篩查來說，NGS檢測(cè)在同類中的性價(jià)比遠(yuǎn)高過其他幾種方法。利用高通量測(cè)序技術(shù)來測(cè)定腫瘤患者中ctDNA片段，根據(jù)分析得到的ctDNA所攜帶的腫瘤基因信息，就能夠全面地反映腫瘤的特征。這一技術(shù)憑借著準(zhǔn)確、靈敏、無(wú)創(chuàng)、高通量、可以以相對(duì)低的成本一次測(cè)上萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)，甚至更多等特點(diǎn)，可以從腫瘤防治診斷、治療參考、用藥指導(dǎo)、病情監(jiān)控、復(fù)發(fā)預(yù)警等方面為醫(yī)生及患者提供有效助力。

中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N201410771006.9)公開了一種利用囊胚腔液游離DNA檢測(cè)胚胎染色體異常的方法，包括以下步驟：囊胚腔液游離DNA的獲取、囊胚腔液DNA的檢測(cè)、游離DNA全基因組擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物分析、基因組DNA進(jìn)行片段化處理、片段化目的DNA進(jìn)行定量分析和片段大小分析、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、生物信息分析。該方法避免了傳統(tǒng)的DNA分析方法只能對(duì)單細(xì)胞基因組的部分區(qū)域進(jìn)行研究的不足，能完整地分析單細(xì)胞基因組的遺傳信息，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)高效；同時(shí)，使用囊胚腔液游離DNA作為檢測(cè)樣本，取材方便、安全，導(dǎo)致后期胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常的概率小，能保證胚胎在后續(xù)發(fā)育中不會(huì)受到影響。

中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N201610018232.9)公開了一種基于大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘的癌癥檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：DNA提取試劑盒、高通量測(cè)序文庫(kù)制備試劑、基因序列比對(duì)軟件、染色體覆蓋度計(jì)算軟件。其中，所述DNA提取試劑用于提取外周血游離DNA，通過所述高通量測(cè)序文庫(kù)制備試劑制備高通量測(cè)序文庫(kù)，通過對(duì)測(cè)序文庫(kù)高通量測(cè)序，利用所述基因序列比對(duì)軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類參考基因組作比較，通過染色體覆蓋度計(jì)算軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以區(qū)分癌癥和非癌癥病人，具體操作為：通過計(jì)算每一條染色體測(cè)序覆蓋度，除以總測(cè)序量，來計(jì)算相對(duì)覆蓋度；健康情況下，人每條染色體均為兩個(gè)拷貝，染色體之間的拷貝數(shù)差異非常小；反之，如果相對(duì)覆蓋度超過一定的閾值，則判斷為疑似癌癥患者。并進(jìn)一步分析判斷腫瘤類型和可能原發(fā)灶器官。

然而，目前采用NGS方法的主流檢測(cè)過程(包括中國(guó)專利申請(qǐng)CN201410771006.9、CN201610018232.9中公開的技術(shù)方案)均會(huì)涉及到PCR擴(kuò)增和測(cè)序，這兩個(gè)過程都會(huì)出現(xiàn)一些系統(tǒng)錯(cuò)誤，如illumina Hiseq平臺(tái)的測(cè)序錯(cuò)誤率在0.05％，在普通大量樣本模板檢測(cè)中問題并不大，但是，在腫瘤早期篩查中，由于本身模板類就是在萬(wàn)分之一到千分之一的范圍之內(nèi)，這些測(cè)序錯(cuò)誤跟我們的檢測(cè)下線在一個(gè)數(shù)量級(jí)，就會(huì)對(duì)結(jié)果造成非常嚴(yán)重的干擾，其次，由于PCR引入的錯(cuò)誤也無(wú)法進(jìn)行有效識(shí)別。所以目前急需要開發(fā)一種新的方法，用于鑒別真正的基因突變和這些系統(tǒng)錯(cuò)誤。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、引物標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用。