[發明專利]一種柱孢菌鑒別用分子標記及引物和探針

在審

• 申請號: 201710128471.4
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106702012A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 郭尚;周林;南曉潔
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所14108
• 代理人: 李毅

技術領域

本發明屬于生物鑒別技術領域，涉及一種真菌的鑒別方法，特別是涉及一種用于鑒別柱孢菌的ITS特異性分子標記，以及用于所述鑒別方法的專用引物、探針和基因芯片。

背景技術

柱孢菌，Cylindrocarpon，屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、柱孢霉屬，是一種常見的土壤寄生菌，地理分布較廣，從熱帶到寒帶地區都有柱孢菌分布的報道。

柱孢菌的寄主主要為一些果樹、林木、花卉和藥用植物等，隨著寄主的不同其危害程度各不相同。在農作物、蔬菜上危害程度較輕，而在果苗、花卉上的危害較大。尤其引致的人參、西洋參的繡腐病，在各參區都有分布，目前中國繡腐病年發病率在25%左右，在主要參區則高達70%，嚴重影響了人參的質量和產量。

柱孢菌是一種常見的植物致病菌，尤其引致的人參、西洋參繡腐病，在各參區都有分布，目前中國繡腐病年發病率25%左右，在主要參區則高達70%，嚴重影響了人參的質量和產量。同時，柱孢菌也是食用菌中常見的致病菌，可以導致食用菌出現病斑、菌柄衰弱等現象，持續感染還會導致子實體萎縮死亡。柱孢菌在食用菌的規模化養殖中會產生極為嚴重的群體感染效益，損害種植戶的經濟利益。因此，在食用菌新品種引進前進行柱孢菌的檢測篩查尤為必要。

對于這種肉眼無法觀察的致病菌，如果采用常規的培養方法，至少需要4～5天的檢測周期，而且其菌落形態還不易明確辨識。

隨著分子生物學技術的快速發展，特別是分于標記和基因標記技術的建立與成熟，為發展簡便、快速、準確的真菌鑒定技術提供了有效手段。基因芯片是一種新型的DNA識別技術，利用芯片的高通量和特異性優勢，可以在芯片上對真菌進行有效辨識，以提高檢測的準確性。同時，基因芯片檢測主要操作步驟依靠儀器設備完成，檢測周期只需要6～8小時，不依賴傳統檢測中人的主觀經驗，可以在短時間內獲得準確的檢測鑒別結果。

發明內容

本發明的目的是提供一種柱孢菌特異性ITS分子標記，以建立一種快速、靈敏、特異性好的柱孢菌鑒別方法。

提供用于所述柱孢菌鑒別方法的引物和核酸探針，是本發明的另一發明目的。

本發明采用基因克隆技術，并結合基因芯片技術，首先獲得了柱孢菌ITS DNA片段中一段高度保守且特異性強的核酸序列，以作為特異性鑒別柱孢菌的分子標記；進而依據該分子標記設計并合成了一組特異性引物和核酸探針，建立了特異性鑒別柱孢菌的方法，并對所建立的方法進行了有效性評估試驗。

為實現上述發明目的，本發明所提供的柱孢菌ITS特異性分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特異性分子標記是使用通用引物ITS1/ITS4對從柱孢菌中提取的總DNA進行PCR擴增，PCR產物進行毛細管測序，測序結果在NCBI中進行全核酸數據庫比對分析，確定出的能夠作為基因芯片檢測靶序列的特征序列。

進而，本發明根據上述靶序列，依據引物與探針設計原則，設計了一對具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于擴增所述ITS特異性分子標記的引物，以及一種具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于檢測所述ITS特異性分子標記的核酸探針。

更具體地，本發明是在引物1的5'端標記有熒光報告基團Hex，并將所述核酸探針進行氨基化處理，即在核酸探針的5'端連接氨基，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針。

引物1：5'Hex-TGTATTTTGCCCTGAAAACT-3'。

引物2：5'-GTTTTACGGCGTGGTTCGCAG-3'。

核酸探針：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。

本發明還提供了一種用于檢測柱孢菌的基因芯片。本發明所述的基因芯片采用本領域常規方法制備，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探針。所述基因芯片采用的片基優選常規的醛基片基，以與所述氨基化的探針配合。

本發明也提供了一種用于鑒別柱孢菌的試劑盒，在所述試劑盒中至少包含有上述的柱孢菌檢測用基因芯片或核酸探針，用于擴增本發明所述柱孢菌ITS特異性分子標記的專用引物和PCR擴增試劑，以及其他必要的相關試劑。

最后，本發明提供了一種鑒別柱孢菌的方法，本發明所述方法是利用上述柱孢菌ITS特異性分子標記對柱孢菌進行鑒定，利用PCR方法獲得的柱孢菌擴增產物中應包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具體地，本發明所述鑒別柱孢菌的方法包括：