[發(fā)明專利]一種條柄铦囊蘑鑒別用分子標記及引物和探針

有效

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• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106702011B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設計）人: 南曉潔;郭尚;周林
• 申請（專利權）人: 山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 太原華弈知識產(chǎn)權代理事務所 14108
• 代理人: 李毅

本發(fā)明涉及一種條柄铦囊蘑鑒別用分子標記及引物和探針，所述條柄铦囊蘑ITS特異性分子標記具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。針對所述分子標記設計特異性檢測條柄铦囊蘑的基因芯片，能在短時間內(nèi)對條柄铦囊蘑進行特異性鑒定，提高條柄铦囊蘑鑒別的準確性和靈敏性，具有快速、準確、成本低的特點。

技術領域

本發(fā)明屬于生物鑒別技術領域，涉及一種真菌的鑒別方法，特別是涉及一種用于鑒別囊蘑菌屬真菌條柄铦囊蘑的ITS特異性分子標記，以及用于所述鑒別方法的專用引物、探針和基因芯片。

背景技術

管涔山地處呂梁山系北端，平均海波1800～2000m，是溫帶大陸性季風氣候和西伯利亞冬季冷氣團交融門戶，降雨量充沛，是山西三大河流的發(fā)源地，植物覆蓋率高，植被分布呈現(xiàn)明顯的垂直帶譜。特殊的地理環(huán)境和氣候環(huán)境造就了該地區(qū)獨特的生物多樣性，而來自管涔山脈的食用菌也因其獨特的風味和營養(yǎng)價值，曾被納為皇室貢品。因此，開展管涔山系食用菌分子標記研究，對于這一地區(qū)特有品種的開發(fā)與保護具有重要意義。

條柄铦囊蘑，Melanoleuca gramrnnopodia，屬于擔子菌綱、傘菌目、白蘑科、囊蘑菌屬，分布于黑龍江、西藏、山西等地，是一種生長在管涔山一帶的著名野生食用菌。條柄铦囊蘑的子實體小，菌蓋直徑2～3cm，色較深，氣味溫和，夏秋季長于林中空地或林緣草地，常常群生，少見單生。

傳統(tǒng)的食用菌分類鑒定主要依據(jù)子實體的形態(tài)學特征，包括擔孢子的大小和子實體真皮菌絲的形態(tài)特征。但子實體的許多形態(tài)學特征往往隨生長條件的不同而發(fā)生變化，同時許多鑒別性特征又經(jīng)常是幾個種所共有，這就給傳統(tǒng)的分類學帶來了很大困難，僅僅依據(jù)形態(tài)學特征進行菌種鑒定不是十分可靠。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，特別是分于標記和基因標記技術的建立與成熟，為發(fā)展簡便、快速、準確的食用菌鑒定技術提供了有效手段。基因芯片是一種新型的DNA識別技術，利用芯片的高通量和特異性優(yōu)勢，可以在芯片上對相近親緣關系的食用菌進行辨識，以提高檢測的準確性。同時，基因芯片檢測主要操作步驟依靠儀器設備完成，檢測周期只需要6～8小時，不依賴傳統(tǒng)檢測中人的主觀經(jīng)驗，可以在短時間內(nèi)獲得準確的檢測鑒別結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種條柄铦囊蘑特異性ITS分子標記，以建立一種快速、靈敏、特異性好的條柄铦囊蘑鑒別方法。

提供用于所述條柄铦囊蘑鑒別方法的引物和核酸探針，是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。

本發(fā)明采用基因克隆技術，并結(jié)合基因芯片技術，首先獲得了條柄铦囊蘑ITS DNA片段中一段高度保守且特異性強的核酸序列，以作為特異性鑒別條柄铦囊蘑的分子標記；進而依據(jù)該分子標記設計并合成了一組特異性引物和核酸探針，建立了特異性鑒別條柄铦囊蘑的方法，并對所建立的方法進行了有效性評估試驗。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所提供的條柄铦囊蘑ITS特異性分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特異性分子標記是使用通用引物ITS1/ITS4對從不同產(chǎn)地的條柄铦囊蘑中提取的總DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行毛細管測序，測序結(jié)果在NCBI中進行全核酸數(shù)據(jù)庫比對分析，確定出的能夠作為基因芯片檢測靶序列的特征序列。

進而，本發(fā)明根據(jù)上述靶序列，依據(jù)引物與探針設計原則，設計了一對具有SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于擴增所述ITS特異性分子標記的引物，以及一種具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于檢測所述ITS特異性分子標記的核酸探針。

更具體地，本發(fā)明是在引物1的5'端標記有熒光報告基團Hex，并將所述核酸探針進行氨基化處理，即在核酸探針的5'端連接氨基，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針。

引物1：5'Hex-CCTTGGATTTGGGGATTGGTT-3'。