[發明專利]東方鈴蟾生物活性肽、基因及其在制藥中的應用

在審

• 申請號: 201710128339.3
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106749596A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 王冉;孔德新;周暢;彭鑫
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10;A61P35/00
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 孫曉鳳

技術領域

本發明涉及一種東方鈴蟾(Bombina orientalis)生物活性肽Bombinin-8及其基因和在制藥中的應用，屬于生物醫學領域。

背景技術

惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病。傳統的化學治療雖然能抑制惡性腫瘤的發展，但在化療過程中使用的抗腫瘤藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有較大的殺傷性毒副作用。在臨床使用中，還可能產生腫瘤耐藥性現象。因此，研究高效、低毒的新型抗腫瘤藥物，已經成為當今腫瘤治療中一個亟待解決的重要問題。肝癌是世界十大惡性腫瘤之一，我國肝癌人群發病率在惡性腫瘤中為第二位。肝癌復發率高，傳統化療藥物對肝癌治療及愈后效果差，尋求新型高效的抗腫瘤藥物是肝癌綜合治療的重要環節。

抗腫瘤活性多肽是一類新型的抗癌藥物，以相對分子量小、低毒性、高活性、易于穿透腫瘤細胞等特點，受到醫藥研究者的廣泛關注。與傳統化學藥物相比，抗腫瘤多肽對腫瘤細胞具有更高的選擇性，能夠以多種方式給藥、易于多途徑吸收、且不易產生耐藥性。

抗生素廣泛用于治療敏感菌所致的感染。但是，由于人們對抗生素的不合理使用，導致許多細菌產生了耐藥性，甚至有產生超級細菌感染的風險，最終無藥可治。所以人們一直在尋找可以代替傳統抗生素的藥物。多肽類抗生素具有分子量小，理化性質穩定，抗菌譜廣等優點，在較低的濃度下可以快速殺死多種細菌，不易產生耐藥性，非常有希望成為新一代抗生素。

兩棲動物相對于其他物種具有特殊的生態地位。特殊的生存環境使得其皮膚及相應腺體進化為該物種特有的代謝系統和機體防御系統，這與其分泌物中所蘊含的許多結構新穎、功能獨特的天然活性物質不無關系。在眾多針對兩棲動物的研究中，以蟾蜍作為生物原料資源，提取天然活性產物的研究最為活躍。蛋白和多肽是蟾蜍毒素中富含的一類天然活性產物，主要包括：抗菌肽、鈴蟾肽、緩激肽、血管緊張素樣肽等。除了以往關注的抗菌消炎的功能之外，近些年研究發現，蟾蜍毒素活性多肽物質，還具有抗腫瘤的特性，可以選擇性殺傷腫瘤細胞。

東方鈴蟾(Bombina orientalis)為盤舌蟾科鈴蟾屬的兩棲動物，廣泛分布于我國東北三省及河北、內蒙、山東等地，并于2000年被中國國家林業局列入國家保護有益的或者有重要經濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄。由于東方鈴蟾地域分布的局限性，國際上對東方鈴蟾分泌物中的活性物質的及其功能性研究的報道尚未多見。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型的同時具有抗菌抗腫瘤活性的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8及其在制藥中的應用。

為實現本發明的目的，本發明提供如下技術方案：

本發明的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8是東方鈴蟾(Bombina orientalis)皮膚分泌多肽基因編碼的一直鏈多肽，分子量2437.93道爾頓，等電點10.5，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且該氨基端序列末端氨基酸的羧基被酰胺化，即該氨基酸序列可具體體現為：

Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe-NH₂(GIGSAILSAGKSIIKGLAKGLAEHF-NH₂)

氨基酸序列酰胺化是部分抗菌肽的典型特征，對其抗菌活性具有重要作用。

編碼東方鈴蟾生物活性肽的基因由560個核苷酸組成，其5’端至3’端序列具體見SEQ ID NO:2，其中，編碼東方鈴蟾生物活性肽成熟肽的基因為第130-204位核苷酸。

本發明的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8具有廣譜抗菌活性和抑制三種肝癌細胞生長增殖的作用，可以用于制備抗腫瘤及抗病原微生物感染藥物。

本發明同時運用基因克隆和氨基酸測序兩種方法得到東方鈴蟾生物活性肽的全序列，使結果更具有準確性和科學性；東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8為單鏈多肽，由25個氨基酸組成，結構簡單，方便化學合成及基因工程制備；該多肽具有廣譜抑菌活性，能夠抑制革蘭氏陰性菌Escherichia coli，革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus和真菌Candida albicans的生長；該多肽還具有顯著的抗腫瘤活性，在微摩爾劑量下即可抑制三種人體肝癌細胞的生長增殖。

附圖說明：