[發明專利]苦豆堿制備肺癌放療增敏劑的應用

有效

• 申請號: 201710127018.1
• 申請日: 2017-03-06
• 公開（公告）號: CN106880841B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 龔志成;徐志杰;顏元良;熊小明;錢龍;曾雙雙;戴爽
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;A61K31/4748;A61K45/06;A61K31/4706;A61K31/7048;A61P35/00;C12Q1/02;G01N21/64;G01N33/50
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及抑制細胞增殖、增強肺癌放療敏感性、調控細胞自噬水平的苦豆堿，通過檢測某些特定的生物標志物，用于評價苦豆堿的抑制放療抵抗肺癌細胞自噬水平和放療增敏效應。

背景技術

肺癌(lung cancer)，全世界腫瘤病人死亡的主要原因，每年大約有160萬肺癌患者死亡。臨床上，放療已成為肺癌患者的主要治療方法之一，然而，最近研究發現，腫瘤細胞逐漸對放療引起的細胞毒效應產生了抵抗作用，導致肺癌放療療效和生存預后顯著變差。因而，闡明肺癌細胞放療放療抵抗的調控機理，有助于發現肺癌治療和預后的新靶點。

細胞自噬(autophagy)是細胞內的一個動態平衡過程，其受到精細的分子調控，通過降解細胞內的受損細胞器、錯誤折疊蛋白質等物質，供細胞正常生命活動需要。目前，研究發現了36個細胞自噬相關分子(autophagy-related genes,Atgs)，包括Atg6/Beclin1、Atg8/LC3、p62等。在應激反應的刺激下，自噬水平的改變，可以為細胞產生應對不良刺激的保護性反應。越來越多的研究表明，細胞自噬在腫瘤的發生發展中發揮重要的功能，特別是在放療或化療藥物的作用下，自噬表現出促腫瘤、抗腫瘤的“雙刃劍”作用，從而影響腫瘤細胞的治療療效。細胞自噬的異常涉及到腫瘤細胞對放化療的敏感性，對細胞自噬調節機制研究的成果正在轉化為腫瘤治療的新靶點。

苦豆堿(Aloperine)是苦參屬植物來源的天然生物堿，在體內外實驗中表現出良好的抗炎、抗腫瘤活性。研究發現，苦豆堿能夠抑制黑色素瘤細胞的增殖、促進細胞凋亡，同時動物實驗表明苦豆堿具有相對安全性、無明顯副作用等特點。在結腸癌細胞中，苦豆堿能夠明顯地抑制細胞增殖、導致細胞周期阻滯，進而產生抗腫瘤活性。然而，尚未有苦豆堿在肺癌放療抵抗效應中的研究發現。因而，闡明苦豆堿增強肺癌放療敏感性的分子機制，將有助于苦豆堿成為制備肺癌細胞放療增敏藥物。

發明內容

本發明的目的是提供苦豆堿作為放療抵抗肺癌細胞自噬水平抑制劑和放療增敏藥物的應用。所述苦豆堿為植物來源的天然化合物，其放療增敏機制主要是改變細胞自噬水平，及其相關的生物標志分子Beclin1、LC3和p62的變化，優選為LC3(Ad-mRFP-GFP-LC3)。通過檢測這些特定的生物標志物，用于評價苦豆堿的抑制放療抵抗肺癌細胞自噬水平和放療增敏效應。

下面對本發明作進一步說明：

本發明確定了苦豆堿抑制細胞自噬水平和增強肺癌放療敏感性的新的分子機制，明確苦豆堿的應用改變了細胞自噬水平與肺癌細胞放療敏感性，評價苦豆堿作為新的肺癌細胞自噬水平抑制劑和放療增敏劑的可行性。

本發明利用Beclin1、p62檢測技術和熒光可視化的Ad-mRFP-GFP-LC3技術，檢測苦豆堿對肺癌放療抵抗細胞中自噬水平的影響，結果發現苦豆堿顯著地抑制了細胞自噬水平，增強了肺癌細胞的放療敏感性。

本發明利用克隆形成實驗和單擊多靶模型評價肺癌細胞的放療抗性，發現與放療敏感細胞A549相比，放療抵抗細胞A549/IR具有顯著的放療拮抗性。

利用細胞增殖實驗和克隆形成實驗，分析苦豆堿對放療抗性細胞增殖的影響，結果發現苦豆堿能夠明顯地抑制放療抵抗細胞A549/IR的增值率；同時，利用流式細胞術和細胞周期檢測點相關分子表達水平變化，分析苦豆堿對放療抗性細胞周期的影響，發現苦豆堿誘導放療抵抗細胞A549/IR發生了G1/S期細胞周期阻滯。

通過苦豆堿與放療的聯合作用下，細胞增殖率的檢測，發現苦豆堿能夠明顯增加放療抵抗細胞A549/IR的放療敏感性。

利用Western blot技術檢測細胞自噬相關分子的變化，發現苦豆堿能夠下調放療抵抗細胞A549/IR中自噬正向調控分子Beclin1的表達、上調自噬負向調控分子p62的表達；利用電子顯微鏡技術檢測細胞內自噬空泡的數量，發現苦豆堿明顯減少了放療抵抗細胞A549/IR中自噬空泡的數量；接著熒光顯微鏡評價Ad-mRFP-GFP-LC3熒光強度，發現苦豆堿能夠抑制胞漿中綠色熒光信號和紅色熒光信號。當苦豆堿與放療聯合作用時，上述自噬相關分子變化、自噬空泡數量的減少、LC3熒光信號減弱等變化均為最明顯，提示苦豆堿改變了放療條件下，放療抵抗細胞A549/IR中的自噬水平，影響了放療的效應。