[發(fā)明專利]用于攜帶磺胺類耐藥基因的沙門氏菌RPA快速檢測的引物及其應用

有效

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• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106893779B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發(fā)明（設計）人: 曲道峰;韓劍眾;項紫瑩;沈楊;朱安怡;齊艷君;康震;宋竹青;魏杰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

本發(fā)明公開用于攜帶磺胺類耐藥基因的沙門氏菌RPA快速檢測的引物及其應用。本發(fā)明設計的引物具有較好的種間特異性和種內(nèi)保守性，該技術(shù)能在一次反應中檢測出沙門氏菌及磺胺類耐藥基因(sul3)，短時間內(nèi)可判斷該菌是否為攜帶磺胺類耐藥基因(sul3)的沙門氏菌，無假陽性的出現(xiàn)，也無需昂貴儀器，因此更加便捷、高效、準確。擴增后片段長度大小各異，可通過電泳進行分開辨別。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測沙門氏菌及磺胺類耐藥基因的重組酶聚合酶擴增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其應用，具體涉及一種可同時檢測出沙門氏菌及磺胺類耐藥基因(sul3)的RPA快速檢測的引物及其應用。

背景技術(shù)

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科中常見的人獸共患病原菌，不僅能導致雞白痢、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等動物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第2位。磺胺類藥物具有價格低、易儲存、抗菌譜廣、藥效顯著等優(yōu)點，目前仍是養(yǎng)殖場的必備藥物。國內(nèi)外大量研究表明，由于磺胺類藥物長期和大量使用，沙門氏菌已經(jīng)對其產(chǎn)生了廣泛耐藥性。大量耐藥菌株的存在和流行，使得本病的發(fā)病率和死亡率都不斷上升，引起人們的廣泛關(guān)注。因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的方法檢測攜帶磺胺類藥物耐藥基因的沙門氏菌。

目前沙門氏菌的快速檢測方法主要有免疫酶試驗、免疫擴散法、乳膠凝集試驗、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)等方法。但在操作程序、檢測時間、特異性檢測等方面尚不理想。重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)是近年來開發(fā)的核酸擴增技術(shù)，相比經(jīng)典PCR技術(shù)，RPA技術(shù)主要優(yōu)勢之一在于等溫。常規(guī)PCR必須經(jīng)過不同溫度環(huán)節(jié)，而RPA反應在常溫下即可進行反應。優(yōu)勢之二在于檢測耗時短。整個過程在10-20分鐘內(nèi)即可完成，且無需變性。優(yōu)勢之三在于靈敏。RPA技術(shù)在縮短反應時間的同時也保持了高靈敏性。優(yōu)勢之四在于操作方便，不需要昂貴儀器，整個反應在水浴鍋或金屬浴中即可完成。優(yōu)勢之五在于結(jié)果讀取多樣化。RPA結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，也可類似real-timePCR對擴增過程進行實時監(jiān)控，還可以通過試紙條讀取結(jié)果。

本方法用RPA技術(shù)對攜帶磺胺類藥物耐藥基因(sul3)的沙門氏菌進行了研究，在保證靈敏、特異的同時，操作簡單、耗時短，能夠在常溫下短時間內(nèi)對靶DNA進行擴增，在檢測沙門氏菌的同時也可檢測沙門氏菌對磺胺類耐藥基因(sul3)。對攜帶磺胺類耐藥基因的沙門氏菌的分子流行病基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)，在獸醫(yī)、食品衛(wèi)生和公共衛(wèi)生等方面具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可同時檢測沙門氏菌及磺胺類耐藥基因(sul3)的RPA快速檢測的引物序列。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明根據(jù)沙門氏菌及磺胺類耐藥基因(sul3)的特征靶基因設計出2對特異性引物F1/R1、F2/R2，見表1。各特異性引物具有高度種內(nèi)保守、種間特異性等優(yōu)點。擴增后片段長度大小各異，沙門氏菌擴增后產(chǎn)物大小為361bp，磺胺類耐藥基因(sul3)擴增后產(chǎn)物大小為198bp，可通過電泳進行分開辨別。

表1、RPA快速檢測特異性引物序列

具體檢測方法包括以下步驟：

步驟(1).樣品DNA提取