[發明專利]用于RPA快速檢測攜帶喹諾酮類耐藥基因的銅綠假單胞菌的引物

有效

• 申請號: 201710126444.3
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107058513B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 曲道峰;韓劍眾;崔心禹;沈楊;張聰聰
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

本發明公開用于RPA快速檢測攜帶喹諾酮類耐藥基因的銅綠假單胞菌的引物及其應用。本發明設計的引物具有較好的種間特異性和種內保守性，該技術能在一次反應中檢測出銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrS)，短時間內可判斷該菌是否為攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS)的銅綠假單胞菌，無假陽性的出現，也無需昂貴儀器，因此更加便捷、高效、準確。擴增后片段長度大小各異，可通過電泳進行分開辨別。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速檢測銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因的重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其應用，具體涉及一種可同時檢測出銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrS)的RPA快速檢測的引物。

背景技術

銅綠假單胞菌是醫院內感染的主要病原菌之一。患血液病、代謝性疾病和惡性腫瘤的患者，以及術后或某些治療后的患者易感染本菌。通過醫護人員可將病菌傳給病人，特別在灼傷和新生兒重癥監護室，是重要的醫院內病原菌。除醫院內獲得感染外，HIV感染者很容易在社區獲得該菌的感染，而且一旦被銅綠假單胞菌感染，常可出現晚期HIV感染的體征。如今由于廣譜抗生素、激素以及免疫抑制劑的廣泛使用，銅綠假單胞菌對多種抗生素快速產生耐藥性在臨床抗感染的一線戰場己是不爭的事實，對慶大霉素、頭孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己產生不同程度的耐藥性，這就使得臨床的抗感染治療顯得越來越困難。而喹諾酮類藥物由于其敏感性極強，作用范圍廣，毒性低，價格適中的特點被廣泛的使用于銅綠假單胞感染病癥的治療中，然而近年來的研究發現其耐藥菌發生率逐年增高，大量耐藥菌株的存在和流行使得由銅綠假單胞所引起疾病的發病率和死亡率不斷增加。這一現象引起世人的廣泛關注，因此我們急需一種快速準確、特異性強、靈敏度高的的現代檢測手段來檢測耐藥銅綠假單胞菌。

目前銅綠假單胞菌的檢測主要包括培養皿法-酶法(β-葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜尋)、基因法(基因搜尋)，但在操作程序、檢測時間、特異性檢測等方面尚不理想。在近些年來科學家的不斷探究中，重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)檢測方法應運而生，它在現有體外核酸擴增原理的基礎上發展起來的恒溫體外快速擴增核酸技術。研究人員只需根據所研究的樣品在對應的生物靶標基因序列中設計RPA對應的特異性引物與探針(引物長度通常需要達到30-38個堿基)，利用單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(Recombinase)、單鏈結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(Polynerase)等三種特定酶，只需在25～43℃的恒溫條件下，便可實現特定核酸序列的擴增且能在5～20min觀察到結果。對比我們常用的PCR技術，RPA的反應更加快速便捷，實現恒溫無需不同的溫度環節，對實驗儀器的依賴性低，可降低實驗成本，實現野外實時檢測。RPA的結果可通過瓊脂凝膠電泳檢測來讀取，也可以通過試紙條進行讀取。

應用RPA技術對樣品中銅綠假單胞菌中喹諾酮類耐藥基因進行研究，在恒溫條件下5-20分鐘內對靶基因進行有效擴增，在檢測銅綠假單胞菌的同時還可檢驗銅綠假單胞菌中的喹諾酮類耐藥基因，對攜帶喹諾酮類耐藥基因的銅綠假單胞菌的研究提供科學依據和理論基礎，在醫藥衛生，公共衛生等方面有著重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可同時檢測銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrS)的RPA快速檢測的引物序列。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下：

為實現上述目的，本發明根據銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrS)的特征靶基因設計出2對特異性引物F1/R1、F2/R2,見表1。各特異性引物具有高度種內保守、種間特異性等優點。擴增后片段長度大小各異，銅綠假單胞菌擴增后產物大小為416bp，喹諾酮類耐藥基因(qnrS)擴增后產物大小為202bp，可通過電泳進行分開辨別。

表1、RPA快速檢測特異性引物序列

具體檢測方法包括以下步驟：