[發明專利]一種GC-MS非靶標方法快速篩查植物差異性代謝物的方法

有效

• 申請號: 201710125438.6
• 申請日: 2017-03-04
• 公開（公告）號: CN106970161B
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 于永杰;佘遠斌;付海燕
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

1.一種GC-MS非靶標方法快速篩查植物差異性代謝物的方法，其特征在于，利用GC-MS全掃描技術獲得植物中不同揮發性物質化學組分信息，利用多尺度高斯平滑提取TIC圖中物質信息，根據物質的質譜信息，采用動態規劃算法校正樣本間的時間漂移，對齊屬于同一物質的色譜峰，使得物質信息在不同樣本間具有可比性，采用最鄰近聚類實現化合物注冊，最后采用多方差分析篩選不同組之間具有顯著性差異的化合物，并將質譜信息輸出為MSP文件，該文件可直接導入至NIST庫進行化合物匹配，然后通過色譜的峰面積確定含量差異；具體的篩選步驟如下：

對所有樣本經過GC-MS分析后的原始采集的數據轉化為CDF格式，然后進行數據分析，針對每個樣本中物質信息的提取分為色譜峰提取和質譜信息表征；不同樣本間的時間漂移校正：選擇物質色譜峰數量最多的樣本作為參照樣本，對其余樣本中的時間漂移逐個校正，使得屬于同一個物質的色譜峰進行對齊；將所有樣本中的時間漂移校正后，利用最鄰近聚類方法將保留時間較為接近的物質注冊成一個化合物，最終建立一個樣本和色譜峰的注冊圖或表；經過內標校正后，用于后續的分析；利用方差分析計算樣本間差異性大的物質，置信水平閾值設定為0.05，將置信水平小于0.05的物質視作差異性化合物，將所有差異性物質的質譜信息輸入成MSP文件，導入到NIST庫中進行匹配，確定物質結構，從而得到差異性物質；然后通過色譜的峰面積確定含量差異；

其中針對每個樣本中物質信息的提取分為色譜峰提取和質譜信息表征的步驟如下：色譜峰提取部分步驟為：(i)提取色譜信號中的局部極小值，一般絕大多數局部極小值對應為儀器噪聲，利用迭代優化剔除屬于色譜峰的極小值；然后再將剩余的對應于儀器噪聲的極小值，通過線性差值完成TIC圖中的基線漂移校正；(ii)針對非儀器噪聲的物質色譜信號為局部極大值的特點，采用不同尺度的高斯函數對基線漂移校正后的色譜信號進行平滑卷積運算，高斯函數尺度范圍1-13，步長為0.1，獲得平滑后的信號，提取出各尺度平滑后色譜信號的局部極大值，通過脊線尋優的方法，將不同平滑尺度下的局部極大值位置鏈接在一起得到色譜，并獲得物質色譜峰位置；

質譜信息表征：對色譜峰提取部分的步驟(ii)通過脊線尋優方法得到的色譜，在提取物質色譜峰信號后，根據剩余的信號部分估計出儀器噪聲水平，剔除信噪比小于3的色譜峰；針對每一個物質色譜峰，提取保留時間下的質譜譜圖，用于表征該物質；

其中樣本的時間漂移的校正采用如下方法：利用物質的質譜信號，通過計算相關系數來表征其相似度，兩個質譜信號的相似度越高，則屬于同一個化學成分的可能性就越大，針對每一個測試樣本，均構建一個“測樣物質×參照物質”的相似度矩陣，針對每一個相似度矩陣，利用動態規劃算法，獲得一組測樣色譜峰和參照色譜峰唯一匹配的結果，該組匹配結果的質譜相似度總和最大，從而實現時間漂移校正。

2.按照權利要求1所述的一種GC-MS非靶標方法快速篩查植物差異性代謝物的方法，其特征在于，針對GC-MS中的TIC進行分析，提取其中的物質信息，具體包括以下條件：

(1)收集待區分的不同組別的植物樣本；

(2)對收集的每一個植物樣本進行前處理，過程為：

樣本冷凍干燥后，粉碎處理，過60目篩；稱量樣本1g，加入濃度為100μg/ml氘代苯乙酮溶液100μL作為內標，氘代苯乙酮溶液是以甲醇為溶劑，然后加入二氯甲烷5ml作為提取液，提取植物樣本化學成分，渦旋3min、超聲1h后，13000r/min離心10min，取1ml上清液，加入100μl BSTFA衍生化試劑，于60℃環境下衍生1h ， 隨后進入GC-MS進行分析；

(3)GC-MS分析條件為:

色譜條件：色譜柱為Agilent DB-5MS柱，60m×2.5mm,i.d.,2.5μm；程序升溫，初始柱溫50℃，以5℃/min升溫至300℃，進樣口溫度280℃，傳輸線溫度230℃， He氣作為載氣，分流比為10:1，流速為1ml，進樣量1μl；

質譜條件：EI源，全掃模式，掃描范圍50-500，采樣頻率3Points/s。