[發(fā)明專利]一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法

有效

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• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106893680B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 王華梁;王敬華
• 申請（專利權）人: 上海市臨床檢驗中心
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發(fā)明涉及一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法，包括：(1)從血液培養(yǎng)陽性培養(yǎng)瓶中抽取1?2ml血液樣本，注入離心管；(2)向離心管中加入50?150mg石英砂和10?20ml富集稀釋液，混勻，靜置，離心得到沉淀；(3)將沉淀震蕩，離心，隨后加入十二烷基硫酸鈉SDS溶液和滅菌蒸餾水，震蕩，除去石英砂；離心，洗滌，即得。本發(fā)明富集真菌菌絲效率高，富集到的真菌雜質少，可用于真菌核酸提取，亦可用于質譜技術直接鑒定真菌，具有廣闊的應用空間。

技術領域

本發(fā)明屬于血液樣本處理領域，特別涉及一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法。

背景技術

隨著社會人口老齡化進程加快，使罹患老年性慢性疾病的人群增加，同時，廣譜抗生素廣泛使用，導管介入性治療、組織活檢等侵入性醫(yī)療操作增多，以及腫瘤、艾滋病、白血病、器官移植等免疫力低下患者的數量不斷擴大。因此，近年來，深部真菌感染的發(fā)病率大幅增加，特別是深部絲狀真菌感染的發(fā)病率正逐年明顯增加，在某些特定人群中其發(fā)病率甚至高于酵母菌感染率。由于深部真菌感染早期缺乏特征性的臨床癥狀，難以在發(fā)病早期獲得病原學診斷，當患者出現持續(xù)高熱而抗生素治療數日無效時，往往提示真菌感染已經擴散到數個器官，錯過搶救患者的最佳時機；臨床實踐表明，不同真菌對抗真菌藥物的敏感性存在較大差異，甚至部分真菌對常用抗真菌藥物天然耐藥或不敏感，致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此，及時、正確地診斷深部真菌感染、尤其是絲狀真菌感染，對成功搶救患者生命，具有非常重要的現實意義。

現行臨床實驗室真菌檢測方法相對滯后。診斷深部真菌感染的傳統方法有形態(tài)學、組織病理學、血清學等方法。形態(tài)學檢查包括真菌直接鏡檢和培養(yǎng)，是目前絲狀真菌病診斷的最常用的方法。但，從血培養(yǎng)陽性的血液培養(yǎng)瓶轉種平板至培養(yǎng)出絲狀真菌典型菌落，一般需要3天至2周，甚至更長時間。

分子生物學技術以其靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，近年得到飛速發(fā)展，現有檢測真菌感染的分子生物學方法也日益成熟，如核酸測序，基因芯片，以及采用質譜技術直接鑒定真菌。因此，從血液樣本中直接富集和分離絲狀真菌，采用分子生物學方法進行直接檢測，而不再依賴于轉種沙保弱平板獲取真菌純培養(yǎng)，是目前臨床微生物學實驗室研究的熱點。然而，絲狀真菌在血液中形成纖細的菌絲，且在患者循環(huán)血液中含量很少，生長緩慢。菌絲與細菌或真菌孢子不同，采用同樣的實驗條件，很難有效地從血液中高效地富集、分離出這類菌絲。

目前臨床常用血液樣本消化處理液中，溶血劑多為氯化銨、醋酸銨等為有毒或微毒物品，如刺激皮膚、粘膜、眼睛、鼻腔、咽喉，損傷眼睛；高濃度刺激肺，可導致肺積水；而且，血液樣本中存在較高濃度蛋白質，甚至有淋巴細胞在血液培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長、繁殖，氯化銨、醋酸銨容易引起蛋白質沉淀，使溶液渾濁，粘滯度增加，不利于絲狀真菌的分離。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法，該方法富集真菌菌絲效率高，富集到的真菌雜質少，可用于真菌核酸提取，亦可用于質譜技術直接鑒定真菌，具有廣闊的應用空間。

本發(fā)明的一種從血液樣本中富集絲狀真菌的方法，包括：

(1)從血液培養(yǎng)陽性培養(yǎng)瓶中抽取1-2ml血液樣本，注入離心管；

(2)向離心管中加入50-150mg石英砂(AR級，25-50目)和10-20ml富集稀釋液，混勻，靜置，離心得到沉淀；其中，富集稀釋液由體積比為10-30:1的80-200g/L尿素溶液(使用前配制)和500-600mM EDTA(pH 8.0)組成；

(3)將沉淀震蕩，離心，隨后加入十二烷基硫酸鈉SDS溶液和滅菌蒸餾水，震蕩，除去石英砂；離心，洗滌，即得富集的絲狀真菌。

所述步驟(2)中的靜置時間為5-10min。

所述步驟(3)中的十二烷基硫酸鈉SDS溶液的濃度為0.5％-10％，與沉淀的體積比為1:10-15。